單核細胞增生李斯特氏菌能力驗證結果討論

張 弓，周 露，馬 蓉

(1.揚州市產品質量監督檢驗所，江蘇 揚州 225000；2.江蘇省寶應縣有機食品質量監督檢驗中心，江蘇 寶應 225800)

1 引言

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)簡稱單增李斯特菌，是一種人畜共患病的病原菌，是常見的食源性致病菌之一，其主要的傳播途徑為食源性傳播，可導致爆發流行[1]。李斯特氏菌具有強致病性，可引起人的敗血癥和腦膜炎，該菌廣泛存在于自然界中，其中，食品中存在單增李氏菌，比如海產品等食品該菌檢出率較高，人類食用含有該菌的食品之后，會造成極大的危害。該菌生命力較強，能在4 ℃的環境中生長并繁殖。因此，在食品衛生微生物檢驗中，必須加以重視。

能力驗證是實驗室進行質量控制和提高檢測能力和水平以及發現檢測過程中存在問題的重要手段，能力驗證利用實驗室間比對來判定實驗室和檢查機構能力的活動[2]，在實驗室進行資質認定和評審的過程中，能力驗證是必查的部分，是對檢驗能力的一種評價。能力驗證結果是CNAS判定申請認可和獲準認可實驗室是否維持其技術能力的重要依據之一[3]。為此，本實驗室參加了中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織的關于單核細胞增生李斯特氏菌的能力驗證。

BAX System Q7全自動病原微生物快速檢測系統是近年來比較流行的，應用比較廣泛的一種快速篩選方法。其原理是以病原菌的特定基因為靶標，利用實時熒光定量PCR對其進行擴增，具有靈敏性和高特異性的特點。雖然食品微生物檢驗國家標準中沒有指定該種方法作為特定檢測方法，但是因為其具有準確、快速的優勢，當面對批量檢測時，可作為輔助方法，快速篩選疑似菌，并結合傳統鑒定方法，能提高工作效率。

2 實驗操作部分

2.1 檢測依據

食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢驗國家標準GB 4789.30-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》[4]和中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心作業指導書。

2.2 儀器和試劑

(1)儀器：高壓滅菌器(日本Hirayama)，電子天平(上海卓精電子科技有限公司)，生化培養箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)，均質器(interscience)，恒溫水浴鍋(金壇市中大儀器廠)，BAX System Q7全自動病原微生物快速檢測系統(美國杜邦公司)

(2)培養基和試劑：含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)，含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)，李斯增菌肉湯LB(LB1,LB2)，PALCAM瓊脂，李斯特氏菌顯色培養基。BAX System Q7全自動病原微生物快速檢測系統試劑盒為美國杜邦公司生產。

2.3 樣品

樣品：單核細胞增生李斯特氏菌能力驗證樣品2瓶，編號為18-C660，18-F999。樣品來自于中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心。

2.4 檢測和鑒定過程

2.4.1 前增菌、增菌和初篩

根據本次參加能力驗證的作業指導書要求進行樣品前處理，在P2實驗室無菌條件下將2瓶西林瓶打開，每瓶用4 mL稀釋液進行再水化，待樣品充分溶解后，將溶解液用移液槍吸出放入預先配制的無菌LB1培養液中(可反復用余下的稀釋液清洗西林瓶內壁，保證樣品在西林瓶中無殘留)。操作各環節應保證無菌，在檢驗的過程中設置陽性對照和陰性對照。將上述增菌液放置于30 ℃生化培養箱中培養24 h。從增菌液中吸取0.1 mL轉種于10 mL LB2滅菌培養液內，置于30 ℃生化培養箱培養24 h。

用BAX Q7試劑盒對增菌液進行處理，具體為在PCR試管中加入200 μL裂解液和2.5 μL蛋白酶，配成預混液，吸取50 μL增菌液至預混液中，設置陽性對照和陰性對照，55 ℃處理60 min，95 ℃處理10 min，4 ℃冷卻5 min，上機。結果見圖1和圖2，單核細胞增生李斯特氏菌會在85 ℃附件出現峰值。經儀器檢測，樣品18-C660為陽性，18-F999為陰性。

2.4.2 分離

在無菌條件下用接種環將LB2增菌液劃線接種于PALCAM瓊脂培養基，同時接種于李斯特氏菌顯色培養基，置于36 ℃生化培養箱中培養48 h。具體結果見表1。

2.4.3 初步篩選

在培養后的平板上用接種環挑取3～5個可疑菌落，分別接種木糖和鼠李糖發酵管，不滅菌，直接在TSA-YE培養基上接種劃線，將各發酵管和TSA-YE培養基分別置于36 ℃生化培養箱中培養24 h。木糖陰性、鼠李糖陽性的培養物(李斯特氏菌生化特性為木糖陰性和鼠李糖陽性)繼續鑒定。經培養，編號為18-C660的樣品木糖發酵管為陰性，鼠李糖發酵管為陽性。編號為18-F999的樣品木糖、鼠李糖發酵管均為陽性。陽性菌種符合。

2.4.4 鑒定

鏡檢：從TSA-YE平板上挑取菌落，做革蘭氏染色，并進行鏡檢，鏡檢結果：編號18-C660染色結果為革蘭氏陽性短桿菌，與陽性菌種革蘭氏染色后的鏡檢結果一樣。

動力試驗：從TSA-YE平板上挑取菌落穿刺接種SIM生化管，培養后觀察結果：18-C660分離的細菌有動力，并呈傘狀生長。

生化鑒定。用陽性單核細胞增生李斯特氏菌做對照(圖3)。對樣品18-C660進行生化鑒定，生化鑒定結果與陽性菌株一致。表2為生化鑒定結果 。

溶血試驗：經溶血試驗，樣品18-C660溶血。

協同溶血試驗：樣品18-C660在靠近金黃色葡萄球菌的接種端溶血增強。

3 結果

通過以上實驗得到編號18-C660樣品檢出單核細胞增生李斯特氏菌，編號18-F999樣品未檢出單核細胞增生李斯特氏菌。

圖1 (18-C660)

圖2 (18-F999)

圖3 陽性對照

4 討論

能力驗證是檢測人員技術能力提升的有效途徑，能力驗證結果滿意，則可以認為該檢測人員具備該項分析檢測技術的能力，同時能力驗證是對儀器設備檢查和期間核查的有效方法。實驗室可通過參加能力驗證提高實驗室內部質量管理、考核檢測人員的檢驗能力、建立新的檢測方法[5]。本次實驗室參加的能力驗證結果滿意。

隨著食品檢驗數量的日趨增多，各實驗室在不斷的提升檢測技術和水平。如何更快捷、更準確的檢測食品中的微生物，從而提高檢測工作效率和縮短檢測周期，是實驗室能否在食品檢測領域提高競爭力和可信度的重要手段。目前針對食品安全檢測主要有兩種方法：一是按照食品安全國家標準通過傳統傳統方法檢測，經過培養、增菌、平板鑒定和傳統生化鑒定。二是利用快速篩選系統和全自動鑒定系統，實現食品微生物快速檢測。雖然傳統的生化鑒定方法準確，但是其過程繁瑣，在面對大批量檢驗任務時，不能提高檢測效率。因此，本實驗室采用了傳統的生化鑒定方法和BAX Q7快速篩選方法，檢測結果一致，但是用BAX Q7系統更快捷方便，也縮短了檢測時效。

表2 TSA-YE平板上可疑菌落純培養物生化結果

杜邦BAXQ7篩選系統靈敏性高，特異性好，在食品檢測和疾病預防控制中心病原微生物檢測得到了廣泛的應用，可大批量的檢測，縮短了檢測時間，提高了檢測效率。為檢測提供明確的方向[6]。但也存在弊端：一是在操作的過程中容易造成交叉污染；二是食品中的死細菌也能檢測出來。這兩種弊端容易造成假陽性結果因此，在操作的過程中應注意，而傳統的生化鑒定則避免了假陽性的檢測結果。

本次能力驗證采用兩種方式檢測，結果一致，同時也獲得了能力驗證滿意的結果，提高了檢測水平，提升了檢驗人員信心，對以后食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測提供經驗，在做大批量檢測任務時，對培養后的產物利用BAX Q7快速篩選系統進行初篩，并結合傳統的生化鑒定系統，能更好、更快、更準確地完成檢測任務。