HPLC-ELSD法檢測無糖型飲料中D-阿洛酮糖

劉文全

（攀枝花學(xué)院，四川 攀枝花 617000）

目前我國市面上所銷售的飲料中，含糖飲料占了相當(dāng)一部分比例，但是含糖飲料的過多攝入與肥胖、齲齒及2 型糖尿病等一系列相關(guān)疾病的發(fā)生有密切聯(lián)系[1-2]。隨著我國居民消費理念的不斷提升，人們開始意識到含糖飲料的危害，對飲料關(guān)注的更多是對營養(yǎng)、健康等需求，因此無糖型飲料越來越受關(guān)注[3-4]。無糖型飲料不意味著飲料沒有甜度或在甜感上有所下降，而是添加一種糖替代品既保持飲品的甜味，又降低飲料的糖含量[5-6]。因為糖帶來的甜味是大部分飲料產(chǎn)品暢銷的基礎(chǔ)，沒有美好的甜感，消費者依然不會買單，因此尋找優(yōu)質(zhì)的糖的替代品成為研發(fā)者的重要課題[7-8]。

D-阿洛酮糖（D-psicose）是 D-果糖的 C-3 差向異構(gòu)體，具有與蔗糖相近的口感及容積特性，其甜度相當(dāng)于蔗糖的70%，但熱量只有蔗糖的0.3%，且與其他D-酮糖（果糖、山梨糖等）相比，其反應(yīng)產(chǎn)物具有突出的凝膠特性、起泡性、乳化穩(wěn)定性以及良好的抗氧化性能，可以改善產(chǎn)品的風(fēng)味、色澤及口感[9-11]。作為一種新型功能性低熱量甜味劑，在食品開發(fā)應(yīng)用中具有重要意義。特別是在飲料方面，近幾年在無糖或低糖飲料中添加D-阿洛酮糖，產(chǎn)品與正常飲料具有相似的口感和甜度[12-15]。

目前，D-阿洛酮糖的檢測研究方法并不多，本試驗參照飲料中糖類物質(zhì)的檢測研究方法[16-18]，并結(jié)合其自身不易揮發(fā)、不易電離等特點，選擇液相色譜法檢測，并結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD）對糖類物質(zhì)無特性的檢測要求，只基于樣品顆粒對光的散射與質(zhì)量呈指數(shù)關(guān)系的特點，應(yīng)用于無糖飲料中D-阿洛酮糖的檢測，并優(yōu)化檢測參數(shù)，開發(fā)一種簡單、快捷的高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器（high performance liquid chromatography-evapo rativelightscatteringdetector，HPLC-ELSD）的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2695 型高效液相色譜系統(tǒng)、2428 型示差折光檢測、2424 型 ELSD 檢測器：Waters 公司；D-阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)品：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 樣品來源

樣品均為隨機(jī)購買市場上銷售的無糖型飲料。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX 糖分析色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.2 檢測器的選擇對糖分色譜行為的影響

糖類物質(zhì)的檢測一般都可以用示差折光檢測（differential refraction detection，DRID）和蒸發(fā)光散射檢測（evaporative light scattering detector，ELSD）這兩種通用型來檢測，本試驗對兩種檢測器分析比較后，選擇較合適檢測D-阿洛酮糖的檢測器。

1.3.3 流動相體系對D-阿洛酮糖色譜行為的影響

蒸發(fā)光散射檢測器的流動相選用是易揮發(fā)的溶劑，所以本試驗配制不同比例的流動相Ⅰ（乙腈∶水=10∶90，體積比）、流動相Ⅱ（乙腈∶水=20∶80，體積比）、流動相Ⅲ（乙腈∶水=30∶70，體積比）、流動相Ⅳ（乙腈∶水=40∶60，體積比），考察不同流動相體系對D-阿洛酮糖色譜峰的影響。

1.3.4 蒸發(fā)光散射檢測器條件的優(yōu)化

由于蒸發(fā)光檢測器需要將樣品和流動相進(jìn)行霧化和蒸發(fā)，因此影響霧化和蒸發(fā)的漂移管溫度、載氣壓力這兩個參數(shù)十分關(guān)鍵，這兩個參數(shù)主要是影響色譜圖中的信噪比和目標(biāo)物的峰面積，所以需要對這兩個參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。試驗考察了不同漂移管溫度（40、50、60、70、80 ℃）和不同載氣壓力（10、20、30、40、50 psi）（1 psi=6.895 kPa）對檢測D-阿洛酮糖的影響。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取一定質(zhì)量D-阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 g/100 mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行儀器分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 前處理條件的優(yōu)化

無糖型飲料中D-阿洛酮糖的提取，一般選用液液提取法進(jìn)行提取，并選擇HLB 小柱進(jìn)行凈化富集。參考相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合樣品性質(zhì)[19-20]，選擇20%乙腈溶液進(jìn)行D-阿洛酮糖的提取，并分別比較不同料液比、洗脫液對目標(biāo)物測定值的影響。

1.3.7 加標(biāo)回收試驗

以市售無糖型飲料為基質(zhì)，加入D-阿洛酮糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇優(yōu)化后的前處理條件操作，上機(jī)檢測，計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測器的選擇對D-阿洛酮糖色譜行為的影響

蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器對D-阿洛酮糖色譜圖的影響見圖1。

結(jié)果如圖1所示，示差折光檢測器（DRID）和蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）均采用外標(biāo)法定量，都屬于通用型檢測器。但是相比較示差檢測器，蒸發(fā)光檢測器的靈敏度更高，基質(zhì)干擾更小。這是由于兩種檢測器的不同檢測原理決定的，示差檢測器采用的原理是利用連續(xù)檢測樣品液流路與參比流路間液體折光指數(shù)差值來得到數(shù)值；而蒸發(fā)光檢測器采用的原理是將樣品液霧化形成微霧滴，然后在加熱的漂移管中將微霧滴中的溶劑蒸發(fā)，余下的固態(tài)目標(biāo)物在光散射檢測池中得到檢測數(shù)值。同樣濃度的D-阿洛酮糖，在蒸發(fā)光檢測器中得到的目標(biāo)峰響應(yīng)值更高，穩(wěn)定性更好，所以試驗選擇蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行檢測。

圖1 蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器對D-阿洛酮糖色譜圖的影響Fig.1 Effect of ELSD and DRID on D-psicose sugar chromatogram

2.2 流動相體系對D-阿洛酮糖色譜行為的影響

流動相對D-阿洛酮糖色譜圖的影響見圖2。

圖2 流動相對D-阿洛酮糖色譜圖的影響Fig.2 Effect of mobile phase on D-psicose sugar chromatogram

結(jié)果如圖2所示，流動相中乙腈的比例對D-阿洛酮糖的保留時間影響顯著，隨著乙腈比例的增加，D-阿洛酮糖保留時間明顯提前，容量因子逐步減小。當(dāng)乙腈含量低于20%（體積分?jǐn)?shù)）時，D-阿洛酮糖易于飲品中的乳糖、蔗糖峰形重疊，當(dāng)飲品中含有乳糖或者蔗糖時，可能會造成假陽性，其中流動相Ⅲ（乙腈∶水=30∶70，體積比）的分離度最好，D-阿洛酮糖能與飲料中常規(guī)添加的糖類（葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖）能分開，且分離度較好，出峰時間合適。

2.3 蒸發(fā)光散射檢測器條件的優(yōu)化

2.3.1 載氣壓力條件的優(yōu)化

試驗保持漂移管溫度50 ℃，考察0.10 g/100 mL D-阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同載氣壓力下，信噪比（S/N）以及目標(biāo)物峰面積的變化情況。載氣壓力對D-阿洛酮糖色譜峰的影響見圖3。

圖3 載氣壓力對D-阿洛酮糖色譜峰的影響Fig.3 Effect of carrier pressure on chromatographic peaks of D-psicose

結(jié)果如圖3所示，載氣壓力對色譜圖的信噪比影響較大，對目標(biāo)物峰面積的影響較小。載氣壓力對色譜圖的信噪比影響呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這可能是由于被測樣品溶劑以微霧滴形式進(jìn)入漂移管時，載氣壓力的調(diào)節(jié)主要影響樣品溶劑的霧化程度，體現(xiàn)形式就是信噪比的變化。載氣壓力過小，霧化不充分，過大則可能導(dǎo)致目標(biāo)物的損失，信號值降低。當(dāng)載氣壓力為30 psi 時，信噪比達(dá)到最高，試驗選擇載氣壓力為30 psi。

2.3.2 漂移管溫度條件的優(yōu)化

試驗保持載氣壓力為30 psi，考察0.10 g/100 mL D-阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同的蒸發(fā)管溫度下，信噪比（S/N）以及目標(biāo)物峰面積的變化情況。漂移管溫度對D-阿洛酮糖色譜峰的影響見圖4。

結(jié)果如圖4所示，漂移管溫度在40 ℃增加到90 ℃時，對信噪比（S/N）的影響不大，但是目標(biāo)物峰面積的影響較明顯，其整體呈下降趨勢。這可能是由于漂移管溫度越高，霧化樣品液的量越大，霧化液排空時損失的目標(biāo)物越多，導(dǎo)致目標(biāo)物的峰面積的變小。但是當(dāng)蒸發(fā)管溫度超過60 ℃后，目標(biāo)物的峰面積更趨平緩，考慮到溫度太低溶劑揮發(fā)不完全，基線不穩(wěn)，試驗選擇漂移管溫度為60 ℃。

圖4 漂移管溫度對D-阿洛酮糖色譜峰的影響Fig.4 Effect of drift tube temperature on chromatographic peaks of D-psicose

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗證D-阿洛酮糖在乙腈∶水=30∶70（體積比）流動相體系中的線性關(guān)系，配制了D-阿洛酮糖濃度分別為 0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 g/100 mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。試驗結(jié)果表明，D-阿洛酮糖在0.01～0.80 g/100 mL 內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.99），結(jié)果見表1。

表1 D-阿洛酮糖的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of D-psicose

2.5 前處理條件的優(yōu)化

2.5.1 提取溶劑的選擇

稱取2.0 g 樣品與20%乙腈提取液分別按1∶2、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）的比例混合，超聲提取30 min 后，在優(yōu)化好的儀器條件下測定，以加標(biāo)回收率為比較依據(jù)。不同比例提取液對D-阿洛酮糖的回收率的影響見圖5。

圖5 不同比例提取液對D-阿洛酮糖的回收率的影響Fig.5 Effect of different proportions of extracts on the recovery of D-psicose

結(jié)果見圖5所示，當(dāng)料液比為 1∶5、1∶10（g/mL）時，D-阿洛酮糖的測定回收率明顯高于 1∶2、1∶15、1∶20（g/mL）時的含量。溶劑過少時，兩相濃度梯度小，使D-阿洛酮糖不能完全溶出。隨著料液比的增大，兩相濃度梯度増大，D-阿洛酮糖逐漸溶出，回收率不斷增加；料液比 1∶5（g/mL）時，D-阿洛酮糖的測定值最高，且誤差線較小。當(dāng)料液比達(dá)到1∶10（g/mL）時，進(jìn)一步增加溶劑的量，可能會溶解更多樣品中的其他的物質(zhì)，妨礙D-阿洛酮糖的提取分離，導(dǎo)致D-阿洛酮糖的含量下降。而溶劑過多導(dǎo)致提取液濃度較低，不利于后續(xù)高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測，增大測定結(jié)果的誤差，同時也會造成資源浪費，所以本試驗的料液比選用1∶5（g/mL）。

2.5.2 洗脫液的選擇

本試驗選用HLB 固相萃取小柱對D-阿洛酮糖進(jìn)行凈化和富集，在對小柱的洗脫液方面分別比較了超純水、25 %、50 %、75 %、100 %的甲醇溶液（體積比）5 種溶液的洗脫效果，結(jié)果以回收率為比較依據(jù)。洗脫液對D-阿洛酮糖回收率的影響見圖6。

圖6 洗脫液對D-阿洛酮糖回收率的影響Fig.6 The effect of eluent on the recovery of D-psicose

結(jié)果如圖6所示，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為25%時，D-阿洛酮糖的回收率都比較高，此時25%甲醇的溶液洗脫能力較強(qiáng)，能較完全地洗脫目標(biāo)物，所以本試驗選擇體積分?jǐn)?shù)為25%的甲醇溶液作為樣品的洗脫液。

2.5.3 洗脫液體積的選擇

在選用25%甲醇作為HLB 固相萃取小柱洗脫液的基礎(chǔ)上，比較了洗脫液體積對D-阿洛酮糖回收率的影響。分別比較了超純水 1、2、3、4、5 mL 5 種體積對D-阿洛酮糖目標(biāo)物洗脫效果的影響。洗脫液體積對D-阿洛酮糖回收率的影響見圖7。

結(jié)果如圖7所示，隨著洗脫液體積不斷增加，D-阿洛酮糖的回收率逐漸升高，但洗脫液體積達(dá)到3 mL以后再增加洗脫劑體積，D-阿洛酮糖回收率并沒有明顯增加，此時HLB 固相萃取小柱中的目標(biāo)物較完全地被洗脫出，再增加洗脫液體積對D-阿洛酮糖的回收率影響不大，所以選擇3 mL 為洗脫體積較合適。

圖7 洗脫液體積對D-阿洛酮糖回收率的影響Fig.7 The effect t of eluent volume on the recovery of D-psicose

2.6 加標(biāo)回收與相對偏差

分別添加 0.01、0.1、1.0 g/100 mL 共 3 個梯度濃度的D-阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，每個濃度重復(fù)測定5 次，結(jié)果見表2。

表2 方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表2可見，D-阿洛酮糖的加標(biāo)回收率范圍為91.5%～94.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為3.1%～6.8%，表明本試驗所建立的檢測D-阿洛酮糖的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

3 結(jié)論

本文建立了一種高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器（HPLC-ELSD）檢測無糖型飲料中D-阿洛酮糖的分析方法。結(jié)果表明，在流動相為乙腈∶水=30∶70（體積比），在載氣壓力為30 psi、漂移管溫度60 ℃的條件下D-阿洛酮糖能得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時間合適。樣品在經(jīng)20%乙腈提取后，采用HLB 固相萃取柱法以3 mL 25%甲醇作為洗脫溶劑，可實現(xiàn)對D-阿洛酮糖的凈化與富集，準(zhǔn)確有效地檢測無糖型飲料中的D-阿洛酮糖。