單因素考察甘草瀉心湯超微飲片中甘草酸提取工藝研究

吳柱，譚軍華，王靈芝，魏丹丹，3

（1.長沙醫學院，湖南長沙 410219；2.湖南省九典制藥股份有限公司，湖南長沙 410329；3.湖南易能生物醫藥有限公司，湖南長沙 410006）

甘草瀉心湯出自《傷寒論》，處方組成為甘草四兩（君）、黃芩三兩、干姜三兩（臣）、半夏半升、人參三兩（佐）、黃連一兩、大棗十二枚（使），主治傷寒，醫反下之，并自利，心下痞硬，干嘔，心煩不安。目前，甘草瀉心湯臨床應用廣泛，在消化系統、腫瘤化療后消化道、艾滋病難治性口腔潰瘍、糖尿病、皮膚瘙癢癥等治療中效果突出[1-3]。方劑中甘草是君藥，君甘草以保胃氣，瀉心，非瀉結熱，因胃虛不能調劑上下，致水寒上逆，火熱不得下降，結為痞，甘草的主要有效成分為甘草酸。

目前對甘草瀉心湯研究僅限于作用機制和臨床療效，關于甘草瀉心湯超微飲片質量標準研究方面至今無相關報道。本論文旨在對甘草瀉心湯超微飲片提取工藝進行研究，采用HPLC法測定甘草酸，為甘草瀉心湯超微飲片的質量標準建立研究基礎。

1 儀器與試藥

1100高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）、AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）等。

甘草、黃芩、干姜、半夏、人參、黃連、大棗，購于湖南九芝堂零售有限公司撈刀河藥店，于湖南中醫藥研究院分別超微粉碎；98%甘草酸標準品（上海西隴生化科技有限公司 ST0125），色譜甲醇（天津歐博凱化工有限公司，180810）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 提取工藝研究

2.1.1 簡單回流提取

將甘草瀉心湯超微粉末精密稱量12 g至圓底燒瓶中，加入一定量的溶劑（溶劑分別為乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇）浸泡靜置30 mim，然后按照固液比1∶20[4]的比例加入溶劑共240 mL，回流提取3次，時間分別為 2 h、1.5 h、1 h，將提取液過濾，濾液濃縮成浸膏。

2.1.2 連續回流提取

將甘草瀉心湯超微粉末按比例精密稱取12 g至濾紙套內，加入一定量的溶劑（同2.1.1）至索氏提取器浸漬30 min，圓底燒瓶加入240 mL溶劑，回流提取4.5 h，過濾，濾液濃縮成浸膏。

2.1.3 超聲提取

將甘草瀉心湯超微粉末精密稱量12 g至圓底燒瓶中，加入一定量溶劑（同2.1.1）浸泡靜置30 min，

置于35 ℃的超聲儀中超聲（125 W，55kHz）2 h、1.5 h、1 h[5]，過濾，濾液濃縮成浸膏。

單因素考察不同提取溶劑和方法對甘草瀉心湯超微粉末的影響結果見表1。

表1 三種不同提取溶劑及方法所得浸膏重

表1結果顯示，以浸膏得率為評價指標，以95%乙醇為溶劑采用連續回流提取所得浸膏得率為37.52%，故此提取方法為最佳提取工藝。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液配制

取甘草酸對照品25 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入40 mL甲醇溶解，超聲（300 W，40 kHz）30 min，放冷，定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液配制

將甘草瀉心湯超微飲片精密稱取12 g，按“2.1.2項”下提取，溶劑采用95%乙醇，濾液濃縮成浸膏。浸膏加 10 mL 甲醇溶解，精密量取 5 mL，至 25 mL 容量瓶中，加15 mL甲醇溶解，超聲處理（300 W，40 kHz）30 min，放冷，定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對照樣品配制

將不含甘草的甘草瀉心湯超微粉末按比例精密稱量12g至濾紙套內，按照供試品溶液的制備方法制備即得。

2.3 色譜條件

色 譜 柱:Hyper ODS2 C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相:甲醇 -0.2 mol/L乙酸銨 -冰醋酸（67 ∶33 ∶1）；柱溫:30 ℃；流速:1 mL/min；波長:247 nm；進樣量:20 μL。

取“2.2”項下供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品進樣分析，結果見圖1。

從圖1中A與B可知，在此測定條件下，甘草酸的峰形穩定，保留時間為13.00min左右，圖C可知，陰性對照樣品無干擾。

2.4 線性關系的考察

分別配制甘草酸的對照品溶液（50、100、150、200 μg/mL 和 250 μg/mL)，按 2.3 項下色譜條件進樣分析，以甘草酸濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積（A）為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程為 Y=17112X -234.69，R2= 0.999。結果表明:甘草酸對照品在50～250 μg/mL范圍內線性關系良好。

圖1 甘草瀉心湯超微粉末中甘草酸HPLC圖

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗

精密吸取對照品溶液（150 μg/mL）20 μL注入色譜儀，重復進樣6次，測定峰面積，RSD為0.86%，表明實驗儀器的精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗

精密吸取同一份供試品溶液，于室溫放置，分別于 0、2、4、6、12 h和 24 h各進樣 1次，每次20 μL，測定甘草酸峰面積，RSD為1.92%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.3 重現性試驗

精密稱取同一批供試品溶液12 g，按2.2.2項下制備供試品溶液制備6份，按2.3項下條件分別進樣20 μL，測定峰面積，RSD為1.98%，表明該法重復性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批樣品9份，分別精密加入高、中、低甘草酸對照品儲備液，按2.2.2項下供試品溶液制備方法處理制成供試品溶液，依法進行含量測定，計算回收率，甘草酸的平均回收率為99.81%，RSD為1.95%，表明該方法的準確度良好。

2.6 驗證試驗

取3批10倍量甘草瀉心湯超微粉末，按最優提取工藝進行3次驗證試驗，得三批超微粉末甘草酸含量為360.34、358.28、370.35μg/ml，RSD值為1.77%，說明該提取工藝穩定可靠。

3 結論

通過對甘草瀉心湯超微飲片提取工藝的單因素進行考察，以得膏率為評價指標，以乙醇為提取溶劑的連續回流提取法（索式提取）所得粗提物量最多，且該方法不僅簡單，易重復，而且具有明顯的實用性，可作為甘草瀉心湯超微飲片提取工藝。

本研究摸索甘草瀉心湯超微飲片甘草酸含量測定色譜條件，通過全波長掃描確定在247 nm為檢測波長，流動相以甲醇-0.2 mol/L乙酸銨-冰醋酸（67∶33∶1）為流動相所得到的色譜圖中，化合物的分離效果好，色譜峰形佳且相對穩定。

采用HPLC方法建立了甘草瀉心湯超微飲片定量測定方法，所建立的色譜條件簡單，適宜于經典名方甘草瀉心湯甘草酸化合物含有量測定，有很好的實用性。

為傳承發展中醫藥事業，經典名方的開發受到國家的重視，甘草瀉心湯原方用作治療狐惑病，隨著醫學的研究，其治療范圍漸漸拓寬，但對其質量標準的研究無相關報道，本研究所得結果為甘草瀉心湯超微粉末的質量標準的建立提供一定的參考。