中藥木鱉子促進乳腺癌細胞ZR-75-30自噬研究

高榮，李子晗，馬錦榮，何濤，方怡，鄭蕾

（西安醫學院藥學院，陜西西安 710021）

癌癥是嚴重威脅人類生命的疾病，從天然藥物中篩選具有抗癌活性成分受到國內學者的關注。目前，抗癌中藥及其制劑的開發已成為我國抗癌藥物研究的重要方向[1]。

木鱉子 [學名:Momordica cochinchinensis(Lour.)Spreng.]為葫蘆科苦瓜屬植物木鱉的干燥成熟種子[2-3]，具有攻毒散積、疏結消散之功。已經報道的木鱉子中含有甾體類、三萜及其苷類、烯烴類、氨基酸類和有機酸等，可用于抗癌、抗菌、抗過敏、鎮痛的治療。木鱉子曾作為抗癌中藥制劑楓苓合劑的君藥，經藥效學試驗有顯著的抗癌作用，并且在治療肝癌、胃癌的臨床試驗中療效良好[4-6]。

細胞自噬是存在于真核細胞內的一種依賴溶酶體的細胞死亡途徑，胞內損傷的蛋白質和細胞器通過自噬作用被降解，產生的氨基酸、脂肪酸等再被細胞重新利用。誘導自噬的發生，可以保持細胞穩態，清除腫瘤細胞內折疊異常的蛋白和功能異常的細胞器，從而降低腫瘤的發生率，然而當腫瘤形成，自噬可降解腫瘤細胞內變形的蛋白質和細胞器，為其生長提供營養及能量，促進腫瘤生長[7]。自噬的發生可分為四個階段:分隔膜的形成、自噬體的形成、自噬體的運輸融合和自噬溶酶體的裂解[8]。自噬的調控因素主要有Beclin1、LC3、mTOR等[9]。

因此，何種藥物可以誘導腫瘤細胞自噬，成為當今腫瘤治療的熱門方向[10]。本次實驗選擇乳腺癌細胞ZR-75-30，探究中藥木鱉子是否通過細胞自噬發揮其抗癌功效。

1 實驗部分

1.1 細胞、試劑與儀器

人乳腺癌細胞系ZR-75-30，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

MTT（Sigma）、胎 牛 血 清（HyClone）、RPMI 1640培養基（HyClone）。

倒置顯微鏡（Nikon）、酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad）。

1.2 實驗方法

1.2.1 試藥提取

稱取木鱉子碾碎后原藥材10 g，加入100 mL雙蒸水，浸泡過夜，水浴回流提取兩次，每次1.5 h，合并上清液，加入3%活性炭，80℃蒸煮脫色30 min，以8000 r/min離心 10 min，收上清液蒸發干燥，得到木鱉子水提取物（CMSWE），4℃保存。用時DMSO溶解為 0.1 g/mL，保存于 4℃冰箱。

1.2.2 MTT法

取處于指數生長期的ZR-75-30細胞消化稀釋濃度4×104mL-1于96孔板，隔日加入不同濃度藥液，48h后取出，加入MTT，4 h后加入150 μL DMSO使甲臜溶解，用酶標儀在490 nm處測定每孔吸光度（OD）。

1.2.3 集落形成實驗

取處于指數生長期的ZR-75-30細胞消化稀釋濃度1×103mL-1于6孔板，隔天加入不同濃度的藥物。15天后每孔用甲醇固定15 min，0.1%結晶紫染色15 min，用PBS洗兩次進行拍照。

1.2.4 流式細胞術

取處于指數生長期的ZR-75-30細胞消化稀釋濃度 3×105mL-1，加藥后培養 48 h，消化細胞，放置染色1 h，濾網過濾，用流式細胞儀檢測。

1.2.5 熒光染色技術

取處于指數生長期的ZR-75-30細胞消化稀釋濃度2×104mL-1于6孔板，隔天加入不同濃度的藥物。48 h后用單丹黃酰尸胺（MDC）染色，顯微鏡下觀察。

1.2.6 Western雜交

取處于指數生長期的ZR-75-30細胞消化稀釋濃度4×104mL-1于 6孔板，隔日加入不同濃度藥液，48h后取出，收集并裂解，雙縮脲法測定各樣本蛋白濃度。按比例與上樣緩沖液混勻，煮沸5min，得蛋白樣本。10%丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，適當比例稀釋的抗體孵育，顯影，以GAPDH為內參，分析各蛋白條帶光密度值。

2 結果與分析

2.1 木鱉子對ZR-75-30細胞生長的影響

由圖1可得隨著給藥濃度的增大，細胞生長抑制率也逐漸增大。

圖1 木鱉子對ZR-75-30細胞生長的影響

由圖2可得，給藥濃度A-C組逐漸增大，A組為空白組，由圖可見，隨給藥濃度增大，細胞形成集落越弱。

圖2 木鱉子對ZR-75-30細胞集落形成的影響

2.3 流式細胞術

由圖3可以看出，被熒光染色的細胞占總收集細胞的比例由0.7%、8.0%、18.5%到22.6%逐漸增加，說明自噬情況逐漸加強。可得結論:中藥木鱉子可以促進ZR-75-30細胞發生自噬，并且隨給藥濃度的增大，細胞發生自噬的能力逐漸增強。

圖3 木鱉子對ZR-75-30細胞自噬作用的影響

2.4 MDC染色法

MDC染色部分表示了自噬小體，由圖4看出綠色熒光逐漸增強，表示自噬小體的數目隨給藥濃度的增加而增多，說明木鱉子給藥濃度越大，促進自噬能力越強。

圖4 MDC熒光染色圖

2.5 Western雜交

LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值大于1時存在自噬，由圖5可見，空白組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值接近1，隨給藥濃度增大LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值逐漸增大，同時自噬正調控蛋白BECN1含量隨給藥濃度增大而增大。由此可得結論，中藥木鱉子可以促進細胞自噬，且呈濃度依賴性，給藥濃度越大，細胞發生自噬程度越大。

3 結論

本實驗從細胞水平研究中藥木鱉子促進乳腺癌ZR-75-30細胞自噬研究，通過MTT法、集落形成實驗可確定中藥木鱉子對人乳腺癌細胞ZR-75-30的生長具有明顯的抑制作用。通過熒光染色（MDC）、流式細胞術和免疫印跡技術可以明確中藥木鱉子促進細胞自噬的能力呈濃度依賴性。

綜上，推測木鱉子可能通過自噬作用抑制乳腺癌的生長，我們將通過后續實驗進一步研究木鱉子促進自噬的機制。