秸稈生物酶法制備可發酵葡萄糖和木糖的分析研究

慈元釗，付玲弟，周凱旋

（山東尤特爾生物科技有限公司，山東濟寧 273500）

我國是農業大國，農業秸稈每年的產量約為8億噸，大量的農業秸稈基本都沒有得到有效的利用，焚燒、隨意丟棄是主要的處理方式，帶來了嚴重的環境問題。[1-3]

秸稈的主要成分是纖維素、半纖維素、木素。纖維素是由數以萬計葡萄糖分子聚合而成，半纖維素是由戊糖、己糖和糖酸所組成的不均一聚糖，為異質多糖。[4]纖維素、半纖維素均可通過降解產生單糖分子，產生的單糖可進行生物發酵生產乙醇、L-乳酸等。

大部分的實驗研究都對秸稈粉末進行了化學或物理方法預處理。化學方法主要是由稀酸、稀堿、氨水等浸泡。利用稀酸預處理容易造成設備的腐蝕，水解液中產生糠醛、呋喃等物質；堿法處理的預水解液中有大量的木素等物質溶出，后續預水解液處理麻煩。物理方法主要通過對秸稈粉末進行微波、蒸汽爆破等，需要消耗大量的能量，與我國節能減排的大方向不一致。還有一些進行物理化學相結合的方式，雖然木質纖維素的水解率有了大幅度的提升，但實際運用起來困難重重并不現實。

王安東等研究了秸稈雙酶糖化，但秸稈糖化率較低，也不適合推廣。[5]本研究使用尤特爾生產的纖維素酶、木聚糖酶進行處理秸稈粉末，分析不同酶用量以及反應時間下的水解率，為利用秸稈進行生產L-乳酸做好理論基礎實驗。

1 實驗

1.1 實驗材料

玉米秸稈購自山東鄒城農村，粉碎至1mm左右，置于干燥處備用；纖維素酶、木聚糖酶為山東尤特爾生物科技有限公司生產。

1.2 實驗儀器

SP-56型紫外可見分光光度計，DIOONEX-5000離子色譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶活測定

纖維素酶測定參照中華人民共和國輕工行業標準QB2583-2003，木聚糖酶測定參照QB/T4483-2013。

1.3.2 酶活pH、溫度曲線測定

測定纖維素酶、木聚糖酶酶活的pH、溫度曲線，選擇最優的處理條件。

1.3.3 酶解反應條件

按1:10的料液比添加最適酶活的pH緩沖液，然后分別加入相應用量的纖維素酶、木聚糖酶混勻，放入已升溫至最佳酶活條件下的電熱恒溫水浴振蕩鍋中分別反應0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h后取出，振蕩速度為150r/min。放入沸水浴中煮沸10 min，冷卻，離心。離心得到的殘渣再加去離子水洗滌3遍，每遍加水25ml，每次洗滌后離心取上清液，將所有的上清液混合一起測量體積，并測定還原糖濃度，比較不同酶用量以及處理時間下對秸稈的降解效果，以酶解時間為0h的為對照組。

1.3.4 實驗分析方法

秸稈組成成分分析。測定處理前的秸稈中水分、纖維素、半纖維素、木質素的組分，分析方法參照《制漿造紙分析與檢測》中的測試方法[6]。

還原糖測定。酶降解秸稈產生的單糖采用離子色譜進行分析。

2 結果分析與討論

2.1 酶活測定

經測定計算，本次實驗所用的纖維素酶酶活（CMC）在酸性條件下為3500IU/mL；木聚糖酶酶活在中性條件下為98120IU/mL。

2.2 酶活變化曲線的繪制

測定了纖維素酶、木聚糖酶在pH4.0-9.0，溫度30-80℃下的酶活。酶活保留率曲線如圖1。

從酶活保留率曲線來看，纖維素酶在pH5.5，溫度60℃條件下有最大的酶活，pH在5.0-6.0，溫度在50-80℃范圍內，酶活保留率均在60%以上。木聚糖酶在pH6.5，溫度50℃條件下有最大的酶活，pH在5.5-7.0，溫度在40-60℃范圍內，酶活均保留在80%以上。說明尤特爾纖維素酶、木聚糖酶的適用范圍較為廣泛。

2.3 秸稈組分分析結果

秸稈組成成分為纖維素37.43%；半纖維素23.18%；木質素21.03%；水分10.2% 。

2.4 秸稈酶解的單因素實驗

2.4.1 纖維素酶酶用量對秸稈水解的影響

稱取3g（絕干）秸稈粉，以固液比1:10的比例添加pH5.5緩沖液，根據纖維素酶的最適反應條件置于60℃恒溫振蕩水浴鍋中預熱十分鐘，振蕩速度為150r/min。然后以50IU/g（絕干）、100IU/g、150IU/g、200IU/g、250IU/g、300IU/g、400IU/g、500IU/g 加 入纖維素酶稀釋液。在此條件下，反應48h取出，測定葡萄糖含量，計算水解率。實驗結果如圖2。

秸稈的水解率隨纖維素酶用量的增加逐漸增加，但用量超過300IU/g時，水解率提升并不顯著，從使用成本考慮，酶用量選擇300IU/g。由于纖維素酶的作用位點是固定的，隨著用量的增加，發生反應的位點增加，但是酶用量大于作用位點時，水解率便不再大幅度提高。

2.4.2 纖維素酶處理時間對秸稈水解的影響

實驗方法參照2.3.1。纖維素酶添加量為300IU/g。在此條件下，每隔12小時取出一個樣品沸水浴滅活10min。測定水解率，結果如圖3。

隨著處理時間的延長，水解率逐漸提升，反應48h以后，水解率提升幅度越來越小。為了節約成本可將水解時間調整為48h。纖維素酶的處理時間越長，秸稈中的纖維素含量越低，水解率增加幅度也逐漸降低。

2.4.3 木聚糖酶酶用量對秸稈水解率的影響

實驗方法參照2.3.1，緩沖液使用pH6.5的緩沖液，反應溫度50℃，酶用量分別為100IU/g（絕干）、200IU/g、300IU/g、400IU/g、500IU/g、600IU/g、700IU/g、800IU/g。反應時間48h，反應完畢測定水解率。結果如圖2所示。

木聚糖酶處理后的秸稈水解率相對纖維素酶處理的較低，木聚糖酶用量在500IU/g以上時，水解率提升速率較低，因此用量選擇500IU/g。木聚糖酶主要降解秸稈中的半纖維素組分，因為秸稈中半纖維素與纖維素、木質素相互交纏，半纖維素含量又相對較低，因此其水解率明顯低于纖維素的水解率。

2.4.4 木聚糖酶酶處理時間對秸稈水解的影響

實驗方法與條件參照2.3.3，酶用量選擇500IU/g，每隔12h取出一個樣品沸水浴滅活10min。測定水解率，實驗結果如圖3。

隨著處理時間的延長，半纖維素的水解率逐漸增高，48h以后水解率提升幅度較低，因此最佳處理時間選擇48h。

圖2 不同酶用量下的水解率

圖3 不同處理時間下的水解率

2.5 混合酶處理秸稈

根據各單因素實驗，確定纖維素酶、木聚糖酶的用量分別為300IU/g、500IU/g。綜合兩種酶在不同pH以及溫度下的酶活保持率，最終選擇反應條件pH5.5，溫度50℃。根據以上實驗每隔12h取出一個樣品測定水解率，結果如圖4。

圖4 混合酶不同處理時間下的水解率

纖維素酶與木聚糖酶混合使用以后水解率比單獨使用兩種酶的綜合效果要好，水解率在72h達到最高，但到84h時水解率有所降低，是由于水解液中細菌的生長，使得水解率呈下降趨勢。實際生產過程中，可在酶解之前對秸稈進行滅菌處理，同時高溫也會導致秸稈的纖維疏松，提高水解率。

3 結論

實驗過程先測定纖維素酶、木聚糖酶的酶活變化曲線，為秸稈酶解條件的選擇節省了大量的時間和精力。纖維素酶直接處理秸稈粉末，水解率最高可達27.5%。木聚糖酶單獨使用時，其最高水解率可達15%。而在兩種酶的共同作用下，最高水解率為43.1%。

生物酶法直接處理秸稈粉末，目前雖然水解率沒有使用化學方法預處理后再使用酶處理的高，但酶法條件溫和，較容易操作，對環境影響較小。是當前比較理想的一種行之有效地秸稈處理方法。