冷吃兔特定腐敗菌的分離與鑒定

彭先杰 黃婷婷 于躍 袁玉梅 肖夏 鄭連強 袁先鈴

摘 要：對冷吃兔的腐敗細菌進行分離、生理生化鑒定及分子生物學鑒定。通過稀釋平板劃線法分離腐敗微生物，獲得純菌落。將分離的純菌株接種到無菌冷吃兔中富集培養(yǎng)，測定菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量，確定特定腐敗菌;通過生理生化實驗結(jié)果，以《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》為參考進行菌種初步鑒定;通過DNA提取、聚合酶鏈式反應擴增和凝膠電泳將菌株準確鑒定到種。結(jié)果表明：引起冷吃兔腐敗變質(zhì)的特定腐敗菌為沃氏葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。

關鍵詞：冷吃兔;特定腐敗菌;生理生化鑒定;分子生物學鑒定

Abstract： Bacteria from spoiled cold spicy rabbit meat were isolated and identified by physiological， biochemical and molecular biological methods. The pure strains， obtained by the streak plate method， were re-inoculated onto sterile spicy rabbit meat and enriched. The aerobic bacterial count and total volatile basic nitrogen （TVB-N） content were measured to identify the specific spoilage organisms （SSO）. These strains were tentatively identified according to the Bergeys Manual of Determinative Bacteriology and the Manual for Systematic Identification of Common Bacteria and further identified to the species level by sequential DNA extraction， polymerase chain reaction amplification and gel electrophoresis. The SSO in cold spicy rabbit meat were Staphylococcus warneri and Bacillus subtilis.

Keywords： cold spicy rabbit meat; specific spoilage organisms; physiological and biochemical identification; molecular biological identification

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190314-057

中圖分類號：TS251.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）05-0019-05

引文格式：

彭先杰， 黃婷婷， 于躍， 等. 冷吃兔特定腐敗菌的分離與鑒定[J]. 肉類研究， 2019， 33（5）： 19-23. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190314-057.? ? http：//www.rlyj.net.cn

PENG Xianjie， HUANG Tingting， YU Yue， et al. Isolation and identification of specific spoilage organisms in cold spicy rabbit meat[J]. Meat Research， 2019， 33（5）： 19-23. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190314-057.? ? http：//www.rlyj.net.cn

兔肉具有高蛋白、高賴氨酸、高卵磷脂、高消化率、低脂肪、低膽固醇、低脲酸及低熱量的“四高四低”特性，富含維生素、硫胺素、核黃素、不飽和脂肪酸、各種礦物質(zhì)、少量的碳水化合物和脂肪等，易消化，其中多種氨基酸為人體必需氨基酸，色氨酸和賴氨酸含量均高于其他肉制品，因此具有保健、益智、美容、強身及養(yǎng)胃功能[1-3]。“十三五”以來，我國兔產(chǎn)業(yè)發(fā)展呈持續(xù)增長態(tài)勢[4]。

冷吃兔又名香辣兔，能在常溫下食用，無需加熱，故稱之為“冷吃”[5]。冷吃兔食客多、消費量大，未來消費市場潛力巨大，是市場發(fā)掘兔肉資源、有效利用、增值的重要途徑[6-7]。冷吃兔屬于油浸類產(chǎn)品，脂肪、水分含量偏高，極易受微生物污染，引起產(chǎn)品腐敗[8-9]。目前，每年約有25%的肉類產(chǎn)品在微生物作用下失去其營養(yǎng)價值[10]，引起肉類腐敗的優(yōu)勢菌群稱為特定腐敗菌（specific spoilage organisms，SSO）[11]，SSO對環(huán)境忍耐力強，生長繁殖迅速，具有很強的致腐能力，存在于真空包裝低溫肉制品中的SSO主要為乳酸菌[12-14]，其次是腸桿菌[15]、熱殺索絲菌[16]。為了延長產(chǎn)品保質(zhì)期，減少浪費，研究冷吃兔中特定腐敗微生物影響生產(chǎn)加工的作用機理迫在眉睫。

本研究通過腐敗變質(zhì)冷吃兔的微生物分離，獲得其單菌落，篩選得到引起冷吃兔腐敗變質(zhì)的SSO，并對其進行生理生化實驗，初步將其鑒定到屬，結(jié)合分子生物學鑒定，確定SSO的種類，為抑制冷吃兔優(yōu)勢腐敗菌生長、延長產(chǎn)品貨架期等工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兔肉、香辛料均購于自貢市沃爾瑪超市。

冷吃兔制備：兔肉切丁、腌制、炒制、冷卻、裝袋、抽真空，制備過程嚴格遵守無菌操作規(guī)程，用75%酒精消毒、火焰灼燒制備工具清除雜菌。無菌袋樣品密封保存于25 ℃無菌環(huán)境，待用。

1.2 儀器與設備

DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱（配備先進的數(shù)控加工設備） 上海齊欣科學儀器有限公司;YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌鍋（配備國家專利安全連鎖裝置/手輪式快開門設備） 上海博訊實業(yè)有限公司;Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀（配備專用計算機軟件管理及進樣器系統(tǒng)） 福斯分析儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株腐敗特性實驗

微生物的分離：將腐敗的冷吃兔做成稀釋梯度為10-1～10-7的菌懸液，將后5 個稀釋度的菌液接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h;挑選每個梯度培養(yǎng)基中的典型菌落，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線分離，直至得到純菌落，將分離后的菌種編號為A～J。

SSO的選定：將A～J菌株分別加入滅菌后的冷吃兔中，37 ℃培養(yǎng)24、48、72 h;通過測定菌落總數(shù)和總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量，確定菌株的致腐能力，將致腐能力較強的幾株菌作為SSO。

菌落總數(shù)測定：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[17]。TVB-N含量測定：參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[18]。

1.3.2 SSO的生理生化鑒定

參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[19]，對SSO分別進行革蘭氏染色、生長溫度與耐熱性實驗、需鹽性和耐鹽性實驗、需氧性實驗、接觸酶實驗、淀粉水解實驗、明膠水解實驗、碳源利用實驗、V-P測定實驗、檸檬酸鹽實驗和硝酸鹽實驗。

1.3.3 SSO的分子生物學鑒定

用接種環(huán)沾取分離到的細菌菌株，在聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）反應體系中擴增。16S rDNA基因擴增引物上游序列：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，下游引物序列：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。PCR擴增條件為：94 ℃、5 min，98 ℃、10 s，53 ℃、15 s，72 ℃、20 s;98、53、72 ℃共35 個循環(huán);72 ℃、5 min，4 ℃保持。PCR反應體系為：25 μL 2×Taq-PCR MIX、2 μL 16S rDNA-F、2 μL 16S rDNA-R、2 μL Genomic DNA、19 μL ddH2O。將PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測及膠回收，送成都肇科生物科技有限公司進行測序鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)測序鑒定結(jié)果，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST軟件比對分析，找到相似菌屬（種）后，使用MAGE 5軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗菌株的分離篩選

2.1.1 腐敗菌株的分離

反復平板劃線得到10 株菌株，將其命名為A～J，菌株的菌落形態(tài)具體描述如表1所示。

2.1.2 菌落總數(shù)測定

菌落總數(shù)是判定食品受細菌污染的程度和檢測衛(wèi)生質(zhì)量的標準[20]（國標中菌落總數(shù)需≤105 CFU/g[21]）。由表2可知，培養(yǎng)24 h時，菌株B、D、E、F的菌落總數(shù)明顯高于其他菌株，培養(yǎng)48 h時，除菌株G、I外，其他菌株的菌落總數(shù)均超標。

2.1.3 TVB-N含量測定

揮發(fā)性鹽基氮是動物性食品在酶和細菌的作用下，分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)[22]（國標中TVB-N含量需≤35 mg/100 g[23]）。由表3可知，培養(yǎng)48 h時，菌株D、F的TVB-N含量均超標，遠遠高于其他菌株，說明菌株D、F是引起兔肉腐敗變質(zhì)的腐敗菌，亦為目標菌株。菌株D、F的TVB-N含量在24、48 h快速增加，72 h增加減緩，且菌株D的致腐能力略大于F。菌株D、F對冷吃兔的致腐能力強于其他菌株，是貯藏過程中在菌落總數(shù)和TVB-N含量2 個指標下的目標菌株。因此，菌株D、F是冷吃兔貯藏過程中引起其腐敗變質(zhì)的SSO。

2.2 SSO的生理生化鑒定結(jié)果

革蘭氏染色：革蘭氏染色是鑒別細菌的一種方法，根據(jù)細菌細胞壁上主要成分的差異，將染色后的細菌分成兩大類，即革蘭氏陽性菌（紫色）與革蘭氏陰性菌（紅色）[24]。菌株D的革蘭氏染色結(jié)果呈紫色，革蘭氏陽性菌，為球狀;菌株F呈紫色，革蘭氏陽性菌，為直桿狀。生長溫度與耐熱性：菌株D、F分別在菌體細胞有最大波長（450 nm）處測定，37 ℃時生長量較佳。需鹽性和耐鹽性：菌株D在菌體細胞有最大波長（450 nm）處測定，鹽濃度為2%時生長量較佳;菌株F在菌體細胞有最大波長（450 nm）處測定，鹽濃度在5%時生長量較佳。需氧性實驗：菌株D生長在半固體培養(yǎng)基的表面和底部深層無氧的地方，即菌株D的呼吸類型為好氧兼性厭氧型;菌株F僅在半固體培養(yǎng)基表面生長，即菌株F只能進行有氧呼吸，為好氧性細菌。

接觸酶實驗：菌株D、F與3%的過氧化氫反應產(chǎn)生氣泡，菌株D、F均含有過氧化氫酶，能分解過氧化氫。淀粉水解實驗：菌株D不能分解淀粉，菌株F能分解淀粉。明膠水解實驗：菌株D不能分解明膠，不產(chǎn)生明膠酶;菌株F能產(chǎn)生明膠酶，分解明膠，破壞明膠狀態(tài)。菌株F在明膠培養(yǎng)基上生長，再將培養(yǎng)基放在20 ℃以下，明膠不會凝固，呈液體狀態(tài)。碳源利用實驗：菌株D、F在利用糖類時均不產(chǎn)氣，但能利用某些特定糖類，在生長過程中產(chǎn)酸。V-P實驗：菌株D使溶液呈深紅色，菌株F使溶液呈紅色，故菌株D、F均為陽性。菌株D、F在利用葡萄糖時，將葡萄糖分解成2 分子丙酮酸，丙酮酸在一系列反應下形成乙酰甲基甲醇。檸檬酸鹽實驗：菌株D為陰性，菌株F為陽性。檸檬酸鹽實驗用來檢驗微生物是否能利用檸檬酸鹽并將其作為唯一碳源，結(jié)果表明：菌株D不含有檸檬酸鹽滲透酶，不能利用檸檬酸鹽;菌株F含有檸檬酸鹽滲透酶，能利用檸檬酸鈉作為唯一碳源。硝酸鹽還原實驗：菌株D、F均能使溶液變紅，故均含有硝酸鹽還原酶，能把硝酸鹽還原成亞硝酸鹽、氨和氮。

分析得知：菌株D為革蘭氏陽性菌，好氧兼性厭氧型球菌，判定為革蘭氏陽性好氧球菌屬，無芽孢，不運動，接觸酶陽性，進一步判定為葡萄球菌屬;不產(chǎn)生淀粉酶、明膠酶，能利用葡萄糖、蔗糖和β-D-果糖產(chǎn)酸，不產(chǎn)生吲哚，不利用檸檬酸鹽，能產(chǎn)生脲酶分解尿素，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，與《伯杰氏細菌鑒定手冊》[25]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對比，初步確定為金黃色葡萄球菌的金黃色亞種或沃氏葡萄球菌。

菌株F為革蘭氏陽性菌，好氧型，呈桿狀，有芽孢，產(chǎn)酸，初步判定為革蘭氏陽性好氧芽孢桿菌;接觸酶陽性，有運動性，水解淀粉、明膠，發(fā)酵葡萄糖、乳糖和D-甘露醇產(chǎn)酸，V-P陽性，不產(chǎn)生吲哚，利用檸檬酸鹽，不分解尿素，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。與《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對比，初步確定為枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌。

2.3 SSO的分子學鑒定結(jié)果

菌株D、F的2%瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。

由圖2可知，菌株D為沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri），菌株F為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

3 結(jié) 論

菌株D是革蘭氏陽性球形細菌[25]，顯微鏡下排列成葡萄串狀，不生芽孢，兼性厭氧，菌落為乳白色或微黃色，不透明，無鞭毛，不運動。經(jīng)驗證，菌株D為沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri），是葡萄球菌屬的一種，在普通培養(yǎng)基上能大量生長，在營養(yǎng)豐富的肉制品中極易繁殖，從而引起肉制品腐敗。沃氏葡萄球菌毒性較小，致病過程緩慢;耐熱性強，巴氏殺菌條件下不易殺死，是一種能造成一些免疫力低下人群感染的侵襲性條件致病菌[26]，主要存在于人與動物的皮膚及黏膜上，與人類的動脈栓塞和牙周炎也有一定的關系[27]。

菌株F為嗜溫、好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀細菌，革蘭氏染色陽性，可產(chǎn)生孢子，菌落粗糙、不透明、擴張、污白色或微帶黃色。經(jīng)驗證，菌株F為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），是芽孢桿菌屬的一種，現(xiàn)作為芽孢桿菌屬的模式菌種[28]，其生理特征多樣，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，能液化明膠、胨化牛乳、還原硝酸鹽、提高畜禽生產(chǎn)性能、改善腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境、調(diào)節(jié)腸道發(fā)育、增強機體免疫力，且具有極強的抗逆能力[29-30]。枯草芽孢桿菌在自然界中分布廣泛，極易分離培養(yǎng)，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境[31]。

冷吃兔中的SSO為沃氏葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，其中沃氏葡萄球菌對冷吃兔的致腐能力強于枯草芽孢桿菌。沃氏葡萄球菌存在于動物皮膚表面，冷吃兔中的沃氏葡萄球菌可能來源于肉兔或包裝過程中人體的接觸。枯草芽孢桿菌是常見食品腐敗菌，在肉制品中生長快速，會引起冷吃兔的快速腐敗變質(zhì)，使營養(yǎng)物質(zhì)大量損失。在冷吃兔的工業(yè)化生產(chǎn)中，可以從工藝條件、貯藏條件、包裝條件等環(huán)節(jié)遏制優(yōu)勢腐敗菌的生長，進而延長產(chǎn)品保質(zhì)期，提高產(chǎn)品商業(yè)價值。

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收稿日期：2019-03-14

基金項目：四川省教育廳科技基金項目（15ZA0228）

第一作者簡介：彭先杰（1995—）（ORCID： 0000-0002-1283-9482），女，碩士研究生，研究方向為食品安全工程。E-mail： 1284665667@qq.com

*通信作者簡介：袁先鈴（1979—）（ORCID： 0000-0002-3990-386X），女，副教授，碩士，研究方向為食品安全工程。E-mail： 82745373@qq.com