利用熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR檢測豬瘟活疫苗（細胞源）中的16種外源病毒

孫博 宋新剛 張萌萌 張健 高習文 張立恒 尹輝 郭偉 任德強

摘要：本文為分子生物學方法檢測豬瘟活疫苗（細胞源）外源病毒提供實驗數據。用經過驗證的熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR方法檢測哈爾濱元亨生物藥業有限公司生產的24批豬瘟活疫苗（細胞源）中的16種外源病毒（FMDV、PCV2、CSFVW、BCoV、BVDV、BPIV-3、TGEV、PEDV、RV、PRRSV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1），結果顯示24批豬瘟活疫苗（細胞源）成品均無以上16種外源病毒。

關鍵詞：豬瘟活疫苗;PCR;RT-PCR;外源病毒

中圖分類號：S852.4文獻標識碼：A文章編號：2095-9737（2019）01-0001-04

Abstract：It provides experimental data for the determination of classical live swine fever vaccine（cell source） exogenous virus by molecular biology method.Detection of 16 exogenous viruses （FMDV、PCV2、CSFVW、BCoV、BVDV、BPIV-3、TGEV、PEDV、RV、PRRSV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1） from 24 batches of live classical swine fever vaccine（cell source） produced by Harbin Yuanheng Biopharmaceuticals Co. Ltd.， the results showed that 24 batches of products did not have the above 16 exogenous viruses.

Key words：Living classical swine fever vaccine; PCR; RT-PCR; Exogenous virus

外源病毒的干擾，已經成為疫苗質量問題的隱形殺手，豬瘟活疫苗（細胞源）的外源病毒檢測一項，參照《中華人民共和國獸藥典》（2015年版第三部）要求，需要做熒光抗體檢測、致細胞病變和紅細胞吸附實驗[1]，以下簡稱細胞培養法。哈爾濱元亨生物藥業有限公司，致力于生產行業內最純凈的疫苗，并始終關注檢測方法的研究，希望通過有效的檢測手段，合理、高效的保證產品質量。

哈爾濱元亨生物藥業有限公司采購了14種熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR商品化試劑盒，試劑盒分別經過特異性、敏感性、重復性方法學驗證[2-14]，檢驗方法已完成驗證。現用經過驗證的熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR商品化試劑盒檢測24批豬瘟活疫苗（細胞源）中的16種外源病毒（FMDV、PCV2、CSFVW、BCoV、BVDV、BPIV-3、TGEV、PEDV、RV、PRRSV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1），以期為分子檢測方法提供臨床數據便于試驗分析及在生產過程中有針對性的防止外源病毒污染。

1 材料與方法

1.1 材料

分子檢測試劑盒：豬細小病毒實時熒光PCR檢測試劑盒，豬偽狂犬病毒實時熒光PCR檢測試劑盒，豬圓環病毒1型實時熒光PCR檢測試劑盒，豬圓環病毒2型實時熒光PCR檢測試劑盒，牛皰疹病毒Ⅰ型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，口蹄疫病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，豬瘟病毒野毒株實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，牛冠狀病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，牛病毒性腹瀉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，豬日本乙型腦炎病毒實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒，豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒三重實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，牛副流感病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，哺乳動物呼腸孤病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒（以上材料采購自TaKaRa、Promega、青島巴特菲生物科技有限公司、北京世紀元亨動物防疫技術有限公司）。

哈爾濱元亨生物藥業有限公司連續生產的24個批次豬瘟活疫苗（細胞源）每批3瓶。熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測系統FQD-96A（購自杭州博日科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取

每批豬瘟活疫苗（細胞源）3瓶，用生理鹽水稀釋至完全溶解后混合，根據批號依次排列順序并標記序號。參照試劑盒說明書，進行核酸提取。

1.2.2 擴增

核酸提取后擴增前將試劑盒從-20℃拿出，將試劑混勻后離心待用，每種試劑盒檢測26份樣品，分別為24批樣品、陰性對照、陽性對照，每種檢測項目配制27份體系，提取后的核酸根據說明書要求的程序進行擴增，觀察曲線，并記錄CT值。PCR儀可以同時檢測96份樣品，選取三種外源病毒進行同時擴增，FMDV、PCV2、CSFVW為1組，BCoV、BVDV、BPIV-3為1組，PCV1、MRV、JEV為一組，TGEV、PEDV、RV、PRRSV為1組， PPV、PRV、BHV-1為1組，共進行五次擴增，TGEV、PEDV、RV、PRRSV組樣品數量為52個，其余每組樣品數量為78個。根據說明書在軟件上輸入不同病毒核酸的擴增程序，經過連續檢測直到所有外源病毒檢測項目完畢后進行結果統計。

2 結果

16種外源病毒陽性CT值符合結果判定要求，并出現特定的擴增曲線，陰陽性對照成立，24批豬瘟活疫苗（細胞源）結果為陰性。CT值參見表1，陽性對照擴增曲線參見圖1～圖5。

3 討論

疫苗品質是優良產品的精髓，我們從原材料、硬件設施、生產流程三個層面嚴格控制產品質量，不斷苛求純凈的產品品質。豬瘟活疫苗（細胞源）的制備選用的原材料為細胞、胰酶、牛血清等，根據原材料動物種屬的不同，選取豬源及牛源相關的常見外源病毒作為檢測項目（FMDV、PCV2、BCoV、BVDV、BPIV-3、TGEV、PEDV、RV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1）。采用現代分子生物學先進檢測技術，從細胞、血清、胰酶到半成品、成品依次進行檢測，以加強外源病毒的監測及對外源病毒的來源進行追溯。同時為了保證抗原品系純正，選取豬瘟病毒疫苗毒和野毒株熒光RT-PCR檢測試劑盒分別進行疫苗毒和野毒的雙向檢測，保證疫苗無野毒污染的同時，確保疫苗品系“純正”。在生產流程方面，為了避免產品間的交叉污染，增加高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）分子生物學方法檢測外源病毒項。

根據《中華人民共和國獸藥典》2015年版第三部外源病毒檢測法，針對豬瘟活疫苗（細胞源）用非禽源細胞來源及疫苗靶動物，選用的細胞為MDBK、Vero、PK-15[15]，分別進行實驗。如果在細胞培養法結果出現陽性時，我們可以用已建立的分子生物學方法檢測細胞培養法所使用的原材料，包括MDBK、Vero、PK-15、牛血清、胰酶的檢測，以排除實驗過程中引入的外源病毒，保證細胞培養法實驗結果的準確性。

細胞培養法和分子生物學檢測法兩者相比較，除去原材料及設備設施的不同，檢驗周期也有很大差別。分子生物學方法可以快速、靈敏的檢出外源病毒陽性，如果分子檢測方法檢出陽性，在不能確定是否為假陽性的情況下，則需要對該樣品進行基因測序[16]，同時該樣品接種相對應的細胞，繼代兩次后再進行PCR檢測，進一步驗證實驗結果，避免誤判。

雖然我國2015年版獸藥典未收錄分子生物學檢測方法，但在國際貿易指定試驗中PCR方法已經廣泛使用。如OIE（世界動物衛生組織） 已將檢測藍舌病病毒（BTV）、非洲豬瘟病毒（ASFV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV） 等病毒的PCR方法列為國際貿易指定試驗方法[17]。因此細胞培養法只能確定是否有外源病毒污染，而分子生物學方法可以確定被污染的外源病毒的種類，根據檢測結果，生產過程中可以進行有針對性的控制[18]，從而保證產品的安全性。熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR方法操作便捷、快速、直觀，可以作為細胞培養法檢測外源病毒的有效補充，鑒定疫苗的純凈性并根據污染的外源病毒種類指導生產。

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