高產纖維素酶里氏木霉菌株誘變選育及其發酵條件優化

葛 青，章亭洲,2*，王騰浩，趙 艷

（1.浙江科峰生物科技有限公司，浙江 海寧 314400；2.浙江工商大學，杭州 310000）

纖維素酶可以分解纖維素，添加纖維素酶能夠改善粗飼料的柔韌性，并破壞飼料中粗纖維等抗營養物質，從而提高動物采食量，改善動物消化道健康[1]。添加纖維素酶還可以補充動物體內內源酶的不足，提高對粗纖維的利用率，同時還可以改善消化道酶系組成、酶量及活性，從而提高對營養物質的利用率[2]。因此，纖維素酶對于現代飼料產業具有重要的現實意義和應用價值，但是目前飼用纖維素酶制劑仍然存在功能單一、穩定性差、不耐熱、酶活性低、產率低且成本高等缺陷[3-4]。這是影響纖維素酶制劑廣泛應用于飼料中的瓶頸問題，篩選高產纖維素酶生產菌株具有重要意義[5-6]。

里氏木霉是一種好氧的絲狀真菌，其分泌的纖維素酶是胞外酶，經初提和分離純化就可得到纖維素酶制劑[7-8]。里氏木霉產纖維素酶量高、穩定性好、適應性強，且可以通過物理和化學誘變獲取高產菌株，便于形成規模化生產和管理[9]。研究采用里氏木霉的誘變方法，改造菌株同時優化產酶培養基及發酵條件，并采用培養條件易于控制、生產效率高且不易染菌的液態發酵方法培養菌株，具有重要的現實意義和應用價值。因此，本研究利用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變法處理里氏木霉菌株，選育纖維素酶高產突變株，優化高產纖維素酶突變菌株發酵工藝，確定最適發酵條件，為高產纖維素酶菌株的開發和應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

里氏木霉RUT-C30 購自廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養基

微晶纖維素剛果紅培養基：羧甲基纖維素鈉10 g，乳糖3 g，硫酸銨2 g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水合硫酸鎂0.5 g，剛果紅0.2 g，瓊脂粉20 g，用蒸餾水定容至1 L。

種子培養基：葡萄糖15 g，酵母浸膏20 g，硫酸鎂0.8 g，磷酸氫二鉀6 g，氯化鈣1.0 g，硫酸銨2.5 g，Mandels 微量元素營養鹽1 mL，吐溫-80 2 mL，pH 4.8，用蒸餾水定容至1 L。

發酵產酶培養基：乳糖18 g，玉米槳粉12 g，微晶纖維素10 g，硫酸鎂1 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈣0.5 g，Mandels 微量元素營養鹽1 mL，吐溫-80 2 mL，pH 4.8，用蒸餾水定容至1 L。

1.2 誘變和篩選

1.2.1 孢子懸液制備

取活化培養的里氏木霉平板，用無菌水沖洗，接入種子培養基，30 ℃，150 r·min-1培養。在此過程中記錄孢子萌動過程，以萌動率20%～30%為最佳萌動時間。

1.2.2 ARTP誘變

將里氏木霉孢子液用無菌水稀釋至107～108個·mL-1進行常壓室溫等離子體（ARTP）誘變。照射距離為2 mm，誘變時間分別為0、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260 s。吸取不同誘變時間的菌液均勻涂布于種子培養基中，30 ℃恒溫恒濕培養48 h，記錄菌落數，以無菌水處理的作為空白對照，計算致死率，公式見式1。

致死率/%=（處理菌落數-對照菌落數）/對照菌落數×100% （1）

1.2.3 最優突變菌篩選

將誘變得到的里氏木霉涂布于微晶纖維素剛果紅培養基上，以原菌里氏木霉在微晶纖維素剛果紅培養基上產生的透明圈菌落大小為對照，挑選出平板上突變菌長得快、透明圈大、菌絲短、產孢子晚的單菌落。用0.9%的生理鹽水清洗，然后涂到傳代培養基上，培養4～6 d，接種至固體發酵培養基上進行發酵，測定其總酶活（FPU），比較其酶活性大小以確定高產纖維素酶分解菌株。

1.3 酶活力測定

以濾紙作為底物測定纖維素酶總酶活：將濾紙條置于裝有1 mL 檸檬酸緩沖液（50 mmol·L-1，pH 4.8）的試管中作為反應底物，然后加入500 μL經稀釋的發酵上清液，50 ℃恒溫振蕩反應1 h，反應結束后立即加入3,5-二硝基水楊酸溶液3 mL，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，加入去離子水20 mL，混合均勻后測定540 nm處的吸光值[11]。空白對照為檸檬酸緩沖液（50 mmol·L-1，pH 4.8）500 μL。

酶活的表示用U·mL-1上清液來衡量。其中一個酶活單位（U）定義為指在1 min 內釋放1 μmol 底物所需要的酶量。

1.4 突變菌產酶發酵條件優化

1.4.1 單因素實驗

以基礎培養基為基準，30 ℃恒溫培養，依次對發酵時間（12、24、36、48、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、132、144 h）、硫酸銨濃度（0、0.5、1、1.5、2、2.5 g·L-1）、微晶纖維素濃度（6、8、10、12、14 g·L-1）、接種量（7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%）及攪拌速度（200、300、400、500、600 r·min-1）進行單因素實驗，保持其他條件恒定（乳糖10 g·L-1，微晶纖維素10 g·L-1，玉米漿粉12 g·L-1，（NH4）2SO41.5 g·L-1，MgSO41.2 g·L-1，CaCl21.4 g·L-1，Mandels 微量元素營養鹽1 mL·L-1，吐溫-80 2 mL·L-1，pH 4.8，攪拌轉速為400 r·min-1，通氣量2 vvm。每個重復3次。測定不同發酵條件下突變菌里氏木霉濾紙酶活性，確定這些因素對突變菌里氏木霉產酶的影響，并得到最佳產酶條件。

1.4.2 正交實驗

根據單因素實驗結果，選擇單因素實驗中對產酶影響較大的4 個因素，每個因素設3 個水平，即采用L9（34）正交實驗，對里氏木霉突變菌的產濾紙酶的最優固體發酵條件組合進行優化。

2 結果與分析

2.1 突變株篩選

2.1.1 ARTP誘變與突變菌篩選

將里氏木霉孢子萌發后進行ARTP 誘變，最佳照射時間為200～240 s（致死率達到98%）。經多輪ARTP 誘變，挑選出各輪誘變菌透明圈直徑/菌落直徑較大的初篩突變菌。初篩突變菌經搖瓶發酵進行復篩，突變菌里氏木霉的產酶能力見表1。

表1 里氏木霉RUT-C30 突變菌產酶能力

由表1可知，通過突變菌菌落大小比較，獲得5 個突變菌，經搖瓶發酵復篩發現，突變菌里氏木霉ATR-4的濾紙酶活性較原菌里氏木霉有所提高。鑒于里氏木霉ATR-4 濾紙酶活（FPU）最高，可達2.01 U·mL-1，因此選擇KFDY-4菌株作為產酶發酵條件優化實驗的突變菌。

2.2 突變菌里氏木霉ATR-4產酶發酵條件優化

2.2.1 發酵時間對里氏木霉ATR-4產酶能力的影響

發酵時間對里氏木霉ATR-4 產酶能力的影響見圖1。

圖1 發酵時間對里氏木霉ATR-4產酶能力的影響

由圖1可知，發酵時間對里氏木霉ATR-4產酶能力的影響較大。隨著發酵時間的延長，濾紙酶活性呈現先升高再降低再升高的變化趨勢，發酵時間84 h 時濾紙酶活達到最高，隨后濾紙酶活性隨著發酵時間的延長而呈下降趨勢。由于發酵時間越短，對降低生產成本較為有利，因此選擇里氏木霉ATR-4最佳發酵時間定為84 h。

2.2.2 硫酸銨濃度對里氏木霉ATR-4 產酶能力的影響

硫酸銨濃度對里氏木霉ATR-4 產酶能力的影響見圖2。

圖2 硫酸銨濃度對里氏木霉ATR-4產酶能力的影響

由圖2 可知，濾紙酶活性在硫酸銨濃度為1.5 g·L-1時最高，顯著高于硫酸銨濃度為0、0.5、2.5 g·L-1時（P＜0.05）。因此，選擇里氏木霉ATR-4 最佳的硫酸銨濃度定為1.5 g·L-1。

2.2.3 微晶纖維素濃度對里氏木霉ATR-4 產酶能力的影響

微晶纖維素濃度對里氏木霉ATR-4 產酶能力的影響見圖3。

圖3 微晶纖維素濃度對里氏木霉ATR-4產酶能力的影響

由圖3 可知，微晶纖維素對濾紙酶活性無顯著影響，微晶纖維素濃度在10 g·L-1時，濾紙酶活性相對較高。綜合考慮成本，里氏木霉ATR-4 產酶的最佳微晶纖維素濃度定為10 g·L-1。

2.2.4 接種量對里氏木霉ATR-4產酶能力的影響

接種量對里氏木霉ATR-4 產酶能力的影響見圖4。

圖4 接種量對里氏木霉ATR-4產酶能力的影響

由圖4 可知，接種量在7%～10%時，濾紙酶活性隨著接種量的增加而提高，接種量＞10%時，濾紙酶活性隨著接種量的增加而下降，當接種量為10%時，濾紙酶活性達最高，為2.15 U·mL-1。因此，里氏木霉ATR-4產酶的最佳接種量定為10%。

2.2.5 攪拌速度對里氏木霉ATR-4 產酶能力的影響

攪拌速度對里氏木霉ATR-4 產酶能力的影響見圖5。

圖5 攪拌速度對里氏木霉ATR-4產酶能力的影響

由圖5 可知，攪拌速度在400 r·min-1時，濾紙酶活性最高，顯著高于攪拌速度200、600 r·min-1時（P＜0.05）。因此，里氏木霉ATR-4 產酶的最佳攪拌速度定為400 r·min-1。

2.2.6 正交實驗

通過單因素實驗初步確定里氏木霉ATR-4 產酶的最佳工藝條件為：發酵時間84 h，硫酸銨濃度1.5 g·L-1，微晶纖維素濃度10 g·L-1，接種量10%，攪拌速度400 r·min-1。根據單因素實驗的結果，選擇對里氏木霉ATR-4 固體發酵產酶能力影響較大的4 個因素（發酵時間、硫酸銨濃度、接種量、攪拌速度）進行L9（34）的正交實驗，每個試驗進行3次。正交實驗因素水平表見表2。

正交實驗結果及極差分析見表3，以極差大小確定因素主次順序。從極差分析可知，影響里氏木霉ATR-4 產酶的主要因素是攪拌速度，其次是發酵時間和接種量，硫酸銨濃度的影響最小。里氏木霉ATR-4產酶的最佳組合為A1B1C2D3，即發酵時間78 h，硫酸銨濃度1 g·L-1，接種量10%，攪拌速度400 r·min-1。

表2 正交實驗因數水平表L 9（34）

表3 正交實驗結果

2.2.7 正交實驗驗證

在上述正交實驗優化條件下，對里氏木霉ATR-4 發酵產酶活性的最適發酵條件進行驗證，平行實驗3次，測得濾紙酶活性為4.57 U·mL-1，該結果大于單因素實驗最佳條件的得率。說明各因素間相互作用可以提高里氏木霉ATR-4 產濾紙酶活性，達到更好的提取效果。

3 結 論

采用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術處理里氏木霉Trichoderma reesei RUT-C30菌株，經液體發酵篩選，選擇纖維素酶活性較高菌株并對其液體發酵條件進行優化。在誘變時間240 s 條件下獲得11 株突變里氏木霉ATR-4，其濾紙酶活（FPU）最高可達2.01 U·mL-1。對突變里氏木霉菌株ATR-4的發酵條件優化，篩選得到最佳產酶培養條件為：發酵時間78 h，硫酸銨濃度1 g·L-1，接種量10%，攪拌速度400 r·min-1，乳糖10 g·L-1，微晶纖維素10 g·L-1，玉米漿粉12 g·L-1，MgSO41.2 g·L-1，CaCl21.4 g·L-1，Mandels 微量元素營養鹽1 mL·L-1，吐溫80 2 mL·L-1，pH 4.8，發酵溫度30 ℃，通氣量2 vvm。在此條件下進行驗證實驗，最高酶活可達4.57 U·mL-1。本研究結果表明，常壓室溫等離子體（ARTP）誘變可有效對里氏木霉進行誘變育種，改善其產酶能力。研究選育獲得產纖維素酶能力較穩定的突變里氏木霉菌株ATR-4，可為后續大規模培養與應用提供重要依據。