香芹酚對陰溝腸桿菌的抑菌作用及機理

周 祺，袁 康，劉 芳，都立輝,*

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023 ；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014 ）

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是一種重要的條件致病菌，人體的多個器官、系統包括皮膚軟組織、泌尿道、呼吸系統等都可能由其引發細菌感染性疾病；其可通過氣管以及有創傷的皮膚表面等多個途徑傳播。陰溝腸桿菌對營養的要求較低，其廣泛存在于動物腸道中，由其引起的食物中毒事件也時有發生[1-3]。近年來，隨著抗生素等抗菌藥物的頻繁使用，陰溝腸桿菌的耐藥性問題也得到了越來越多的關注[4-5]。鑒于食品中豐富的營養環境，陰溝腸桿菌可在多種食品中繁殖。這不僅導致了食品的腐敗變質，還造成了相應食品的安全隱患，經傳統熱殺菌和普通化學殺菌制備的食品中常能檢出這類細菌的存在。因此，控制陰溝腸桿菌的生長、減少由其引起的食物中毒事件是食品相關工作者的目標。

香芹酚又名2-甲基-5-異丙基苯酚，分子式為C10H14O，是牛至和百里香等植物精油的主要成分[6]。香芹酚易溶于乙醇，幾乎不溶于水。在日常生活中，香芹酚可用于制作香料、食品添加劑、驅蟲劑、衛生殺菌劑、防腐劑等。近年來，香芹酚的抑菌性也受到了廣泛的關注[7-9]。研究發現，香芹酚對微生物、螨蟲等均具有抑制作用[10-11]。前期有研究發現，香芹酚對細菌、霉菌等的細胞形態均存在破壞作用，同時能夠影響細胞的完整性與功能性[12]。所以，推測香芹酚在破壞細胞膜的完整性方面起著重要的作用。本實驗旨在研究香芹酚對陰溝腸桿菌細胞的殺菌效果和作用機制，通過檢測香芹酚處理后陰溝腸桿菌細胞胞外ATP化學發光值，利用激光共聚焦顯微鏡觀察香芹酚處理對細菌細胞膜通透性的影響，并采用掃描電子顯微鏡觀察香芹酚對細菌細胞形態的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香芹酚（純度99%） 湖北鑫潤德化工有限公司；陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae C4） 江蘇省農業科學院；BHI培養基 北京陸橋生物技術有限責任公司；PI 生工生物工程股份有限公司；DiSC3(5)、5(6)-cFDA美國Sigma公司；ATP檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；THZ-C臺式恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設備有限公司；轉盤式激光共聚焦顯微鏡 美國鉑金埃爾默公司；掃描電子顯微鏡德國蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養

陰溝腸桿菌接種于BHI液體培養基中，生長至對數期時將菌液與滅菌后質量分數40%甘油以體積比1∶1混合后保存在-80 ℃冰箱中備用。活化時將凍存的菌液解凍后以體積分數1%接種于BHI培養基中，30 ℃培養12 h。

1.3.2 香芹酚對陰溝腸桿菌的最小抑菌濃度的測定

將生長至對數期（OD600nm＝0.6）的陰溝腸桿菌以體積分數1%接種于一定體積的BHI液體培養基中備用，將香芹酚溶于體積分數60%乙醇中得到初含量為16 μL/mL的香芹酚溶液。把配制好的菌液按體積比1∶1加入二倍稀釋后的香芹酚溶液中，得到香芹酚終含量分別為2、1、0.5、0.25、0.125 μL/mL的體系，以配制好的菌液加水作為空白對照組，置于30 ℃下培養10 h，檢測各處理組在不同時間的OD600nm[13]，以OD600nm無明顯變化的最低香芹酚含量為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3.3 香芹酚抑菌活性的檢測

將陰溝腸桿菌菌液按體積分數1%接種于BHI液體培養基中，培養至對數期備用。取10 mL菌液，離心收集菌泥，加入相同體積的含量分別為0（空白對照組）、0.25、0.5、1、2 μL/mL的香芹酚溶液，將菌懸液放入搖床中，分別在0、30、60、90、120、180 min時取樣，用滅菌生理鹽水按照10 倍體積梯度稀釋[14]。每個樣品取100 μL均勻地涂布于BHI固體培養基上，置于30 ℃培養48 h后對菌落計數。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察香芹酚處理對陰溝腸桿菌細胞形態的影響

將生長至對數期的陰溝腸桿菌以體積分數1%接種于培養基中，加入香芹酚至終含量為0.125 μL/mL，將混合液置于30 ℃培養箱中培養8 h，觀察香芹酚在培養過程中對菌體形態的影響。取生長到對數期的菌液8 mL于滅菌離心管中，6 000 r/min離心8～10 min得到菌泥，分別加入含量為1 μL/mL和2 μL/mL的香芹酚，以加入相同體積滅菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）作為空白對照組，置于30 ℃處理1 h。以5 500 r/min離心10 min，在4 ℃下使用質量分數2.5%戊二醛固定過夜，2 500 r/min、4 ℃離心5 min。加入超純水放置10 min，離心，重復3次；用體積分數遞增（分別為50%、70%、80%、90%、100%）的乙醇各脫水1 次，將樣品固定在鏡片上，噴金、拍照[15-16]。

1.3.5 胞外ATP化學發光值測定

將生長至對數期的陰溝腸桿菌菌液以6 000 r/min離心8～10 min，使用pH 7.4 PBS洗滌兩次，分別將菌泥懸浮在0（對照組）、0.25、0.5、1、2 μL/mL香芹酚溶液中，30 ℃下培養，分別在0、10、30、60、120、180 min時取樣。樣品在4 ℃、12 000 r/min離心1 min，取上清液，加入ATP檢測試劑，混合均勻后按試劑盒說明書測其化學發光值[17]。

1.3.6 細胞膜內外電勢的測定

將5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸與5 mmol/L葡萄糖混合配制緩沖液A，將培養至對數期的陰溝腸桿菌4 ℃、6 000 r/min離心10 min，將菌泥用緩沖液A重懸2 次并離心。將菌泥重懸于含2 mmol/L乙二胺四乙酸的緩沖液A體系中。向樣品中加入熒光探針DiSC3(5)至終濃度為0.5 μmol/L，室溫下放置10～15 min。每個樣品取200 μL，加入1 μmol/L尼日利亞菌素作為陰性對照，加入10 μmol/L纈氨霉素作為陽性對照，并設置菌懸液為空白對照組，以加入香芹酚溶液至終含量分別為0.25、0.5、1、2 μL/mL作為處理組。使用酶標儀檢測其熒光強度，激發波長為622 nm，發射波長為670 nm[18-19]。

1.3.7 細胞膜滲透性觀察

使用熒光探針5(6)-cFDA和PI檢測細胞膜的受損情況[23]。將培養至對數期的陰溝腸桿菌菌液以6 000 r/min離心10 min，向菌泥中加入等體積的PBS作為空白對照組，以加入含量分別為0.25、0.5、1、2 μL/mL香芹酚溶液作為處理組，在30 ℃、200 r/min恒溫振蕩器中培養1 h。樣品再次離心后用500 μL PBS懸浮菌泥。向每個樣品中加入熒光探針5(6)-cFDA至終濃度達到2.5 μmol/L，避光反應10 min；然后加入10 μL紅色核酸熒光染液PI使其終濃度為0.5 μmol/L，避光反應10 min。取2～3 μL菌液轉接到載玻片上，加上蓋玻片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察[20-21]。

1.4 數據統計與分析

每個實驗至少重復3 次，采用Excel 2007軟件處理數據并繪制圖表，使用SPSS 22軟件進行多因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 香芹酚對陰溝腸桿菌的MIC

從圖1可以看出，不同含量的香芹酚溶液對陰溝腸桿菌均有一定的抑制效果，當香芹酚含量在0.5 μL/mL以上時抑菌效果明顯。因此，推測香芹酚對陰溝腸桿菌的MIC為0.5 μL/mL。隨著香芹酚含量的增加，OD600nm下降，說明香芹酚對陰溝腸桿菌的抑制作用隨含量的增加而增強。

陰溝腸桿菌是革蘭氏陰性菌，可以引發人體食物中毒以及皮膚、呼吸道、胃腸道和其他器官的感染，因此其治療和耐藥性受到越來越多的關注。相比于其他抑菌劑[22-23]，較低含量的香芹酚對陰溝腸桿菌有較好的抑制效果。

圖1 不同含量香芹酚對陰溝腸桿菌的生長抑制作用Fig. 1 Effects of different concentrations of carvacrol on the growth of E. cloacae

2.2 不同含量香芹酚對陰溝腸桿菌的殺菌效果

圖2 不同含量香芹酚對陰溝腸桿菌的殺菌效果Fig. 2 Bactericidal effects of different concentrations of carvacrol on E. cloacae

從圖2可以看出，當初始菌落數約為3×108CFU/mL時，0.25、0.5、1、2 μL/mL香芹酚溶液均對陰溝腸桿菌有殺菌作用。即使香芹酚含量為0.25 μL/mL時仍可在一定程度上抑制細菌的生長。香芹酚含量為0.5、1、2 μL/mL時菌落數快速下降，并在60～180 min內完全殺死細菌，與空白對照組相比差異明顯。

2.3 香芹酚對陰溝腸桿菌細胞形態的影響

圖3 經香芹酚處理的陰溝腸桿菌掃描電子顯微鏡照片Fig. 3 SEM images of E. cloacae cells treated by carvacrol

由圖3可知，空白對照組（圖3A）細胞圓潤飽滿、形態完整、表面光滑。0.125 μL/mL處理組（圖3B）部分細胞表面產生孔洞并發生褶皺，且細胞呈黏連狀態，推測細菌的細胞膜在生長過程中受到損傷。1 μL/mL（圖3C）和2 μL/mL（圖3D）處理組細胞均出現了嚴重的干癟和變形。可以看出香芹酚對陰溝腸桿菌細胞的完整性有極強地破壞作用，并使細胞生長時的形態發生變化。

從圖3可以看出，少量的香芹酚就可以在細胞的生長繁殖階段對其產生影響，使細胞變形，形成孔洞，細胞外壁變得粗糙。隨著香芹酚含量的增加，細胞發生更加嚴重的變形，1 μL/mL和2 μL/mL香芹酚幾乎能夠溶解菌體。香芹酚破壞了菌體細胞的完整性，并引起細胞膜通透性和菌體形態的改變。推測香芹酚的抑菌機制可能與其理化特性相關。香芹酚可能首先作用于細胞膜，導致細胞膜通透性的增加，使細胞內ATP等物質滲出，影響其生理活性；隨后，香芹酚可能進一步穿過細胞膜，進入細胞內部并與細胞器相互作用，以抑制菌體活性。

2.4 胞外ATP化學發光值測定結果

圖4 香芹酚處理對陰溝腸桿菌胞內ATP泄漏的影響Fig. 4 Effect of carvacrol on intracellular ATP leakage from E. cloacae cells

圖4 中空白對照組樣品ATP化學發光值初始時為1 819，培養的3 h中無明顯變化。細菌經過香芹酚處理后，各處理組的ATP化學發光值均高于空白對照組；而經過1、2 μL/mL香芹酚處理后，細菌的ATP化學發光值變化明顯，尤其是前10 min變化較大。各處理組的ATP化學發光值大幅增加，說明香芹酚處理會使陰溝腸桿菌細胞內的ATP大量流出。由統計分析結果可知，香芹酚含量和ATP化學發光值之間存在極顯著的相關性（P＜0.01），即陰溝腸桿菌細胞內ATP的釋放是由香芹酚的處理造成的。

細胞內的ATP是儲存和提供代謝能量以及細胞內化學反應的重要小分子物質[24]。本實驗中香芹酚處理增加了陰溝腸桿菌細胞釋放的ATP水平。在0～10 min時，1、2 μL/mL香芹酚處理組的胞外ATP化學發光值變化明顯，推測是因為高含量的香芹酚對陰溝腸桿菌有很強的瞬時破壞作用，增加其細胞通透性，使ATP快速流出。隨著細菌細胞膜被破壞，細胞制造ATP的能力降低，因此ATP化學發光值也有所下降。而ATP的大量流出也證實了細胞膜的破壞以及胞內物質的流出，說明香芹酚對陰溝腸桿菌具有抑制作用。

2.5 香芹酚處理對陰溝腸桿菌細胞膜內外電勢的影響

圖5 香芹酚處理對陰溝腸桿菌細胞膜內外電勢的影響Fig. 5 Effect of carvacrol on the cell membrane potential of E. cloacae

由圖5可知，空白對照組細菌的熒光強度沒有明顯變化，而不同含量香芹酚處理均會引起陰溝腸桿菌細胞膜內外電勢的改變。經香芹酚處理的樣品在第1次檢測時的結果即明顯高于空白對照組，這是由于從加入香芹酚到開始測定需要大約1 min，此時香芹酚已經開始對陰溝腸桿菌產生抑制作用，導致其膜電勢改變。由此可知，香芹酚可以在短時間內使陰溝腸桿菌的細胞膜內外電勢明顯改變。由統計分析結果可知，香芹酚含量和細菌細胞膜內外的電勢變化之間存在極顯著的相關性（P＜0.01）。

細胞受到損傷時，DiSC3(5)探針從細胞膜上釋放，因此能夠檢測到熒光強度增加。細胞膜電勢的變化影響質子進出細胞的動力，阻礙細菌細胞產生ATP，影響小分子物質在細胞內外的交換[25-26]。也有人提出，細胞膜去極化并不是抑菌物質發揮作用的主要方式，但是可以促使抑菌物質進入細胞內部[27]。

2.6 細胞膜完整性觀察結果

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察陰溝腸桿菌細胞膜的完整性Fig. 6 Observation of cell membrane integrity by laser scanning confocal microscope

如圖6所示，細胞膜完整的細胞在染色后呈現綠色熒光，PI則進入細胞膜破損的細胞并將其染成紅色。未經香芹酚處理的空白對照組（圖6A）細胞樣品染色后主要為綠色熒光，而經過0.25、0.5、1 μL/mL和2 μL/mL香芹酚處理1 h后的樣品中紅色熒光隨著香芹酚含量的增加而逐漸增強，說明經過香芹酚處理后陰溝腸桿菌細胞膜遭到破壞，通透性有所增加。

經過兩種核酸熒光探針5(6)-cFDA和PI染色后，可區分細胞膜完整的細胞和膜受損細胞。由于PI與細胞內物質的親和性強于5(6)-cFDA，所以膜受損的細胞在PI進入后導致5(6)-cFDA熒光強度降低。空白對照組幾乎均為綠色熒光；而隨著香芹酚含量的增加，紅色熒光的比例逐漸增加，綠色熒光逐漸減少，2 μL/mL香芹酚處理組視野中幾乎均為紅色熒光。這也進一步證明了香芹酚能夠破壞細菌細胞膜，從而進入細胞內與胞內物質作用[28]。

3 結 論

目前，植物精油的應用受到了廣泛的關注和重視。與其他抑菌劑相比，香芹酚具有無毒、安全性高、抗菌性強等優點[29-30]。本研究發現香芹酚對陰溝腸桿菌有較強的抑制效果。推測香芹酚作用于細胞膜，改變膜電勢，增加細胞膜通透性，使胞內物質流出，導致細胞功能喪失，從而使細胞失活。

由香芹酚對陰溝腸桿菌的MIC和殺菌效果可以看出，香芹酚對陰溝腸桿菌的抑菌效果與其含量成正比，不同含量的香芹酚對陰溝腸桿菌均存在抑制作用。經香芹酚處理的陰溝腸桿菌菌落數迅速減少，且與對照組相比差異明顯。同時，香芹酚接觸細胞時，細胞膜內外的電勢明顯改變，細胞形態被嚴重破壞。通過激光共聚焦顯微鏡觀察，發現經香芹酚處理的陰溝腸桿菌細胞紅色熒光更強，表明其細胞膜的完整性被破壞。因此，香芹酚對陰溝腸桿菌的作用方式主要是通過作用于細菌的細胞膜，破壞細胞膜結構，使細胞膜通透性增加，改變細胞膜內外電勢，使ATP等內容物從細胞內滲出，最終表現出殺菌作用。本實驗研究不同含量的香芹酚對陰溝腸桿菌的殺菌作用和抑菌機理，為香芹酚應用于陰溝腸桿菌的控制提供一定的理論參考。