搖青機械力對烏龍茶脂肪族類香氣形成的影響

周子維，游芳寧，劉彬彬，鄧婷婷，賴鐘雄，孫 云,*

（1.福建農林大學園藝學院，茶學福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002 ；2.福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002 ）

做青是烏龍茶品質形成的核心工藝，是對青葉進行反復的搖青和攤放的過程。搖青機械力是運動力和摩擦力內外效應的作用，使青葉香氣由青氣轉變為花果香[1]。香氣是茶葉感官品質的重要因子，除鮮葉所固有的游離態揮發性物質外，更多香氣物質由對鮮葉采后加工處理所形成。目前，茶樹鮮葉中已被分離鑒定的揮發性物質約有80余種，綠茶中有200余種，紅茶、烏龍茶均約有300余種[2]。茶樹鮮葉中的脂類物質包括了脂肪酸、磷脂、甘油酯、糖脂等，約占干質量8%[3]，相關研究發現，以亞油酸和亞麻酸為代表的長鏈不飽和脂肪酸能作為脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）代謝途徑的底物，在相關酶的催化下，形成大量脂肪族類香氣物質[4-6]。引起脂肪酸酶促氧化反應的酶系統定位在葉綠體中，主要包括LOX、氫氧化裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）以及醇酰基轉移酶（alcohol acyltransferases，AAT）等[7]。不飽和脂肪酸在LOX的作用下氧化成為過氧化物，過氧化物在HPL的進一步氧化裂解下生成C6醛類，C6醛類被ADH還原成為相應的醇類物質，而后部分醇類物質在AAT作用下開始發生酯化反應，形成帶有花果香的葉醇酯類衍生物，除C6醛類物質外，LOX/HPL系統的產物還有12-氧代-9(Z)-月桂烯酸，該物質又會在?3-?2-烯酰-輔酶A異構酶（?3-?2-enoyl-CoA isomerase，ECI）的作用下最終形成反式-2-十二碳烯二酸，即愈傷酸（圖1），它是植物響應外界損傷而轉錄相關抗性基因的信號分子[8]。脂肪族的醇類、醛類、酮類等物質，因低沸點、易揮發而受關注度較低，但脂肪族類香氣在烏龍茶做青[9]、紅茶萎凋[10]、綠茶攤放[11]等工藝過程中，脂肪酸發生裂解變化，為其他高沸點香氣的形成提供良好的基礎，另一方面脂肪酸氧化降解的程度，也能影響成茶貯藏期間的品質變化。

圖1 不飽和脂肪酸的脂肪氧合酶代謝通路Fig. 1 LOX pathway of unsaturated fatty acids

作為植物抗逆生理中重要的應答機制，茶樹LOX代謝途徑的相關基因研究目前以防治茶樹病蟲害居多[12-14]，已登錄的相關基因主要有：LOX1（EU195885）、LOX2（FJ418174）、LOX3（FJ794853）、LOX4（HM370508）、HPL（HM440156.1）及ADH（HM440157.1）。LOX是LOX代謝途徑的關鍵限速酶，它與植物的生長、發育、衰老、防御等密切相關[15]。LOX根據酶裂解位點的差異被分為9-LOX和13-LOX亞族兩類，亞族間在功能和結構上存在明顯差異[16]。HPL被認為是細胞色素P450酶中的特殊類型，專一裂解LOX產物，與植物抗病、抗蟲以及特異氣味的形成有關[17-18]。Matsui等[19]對從茶樹葉片膜結構中純化獲得的兩種形態的HPL進行研究，比較了13-HPL對不同脂肪酸底物的反應活性。相關研究表明，LOX/HPL系統在植物種子萌發[20]、果實成熟[21-23]、逆境脅迫[24-25]等過程中發揮重要作用。ADH是一種廣泛專一性含鋅金屬酶，在動植物體內醇類代謝中起關鍵作用，它將LOX/HPL系統生成的醛類還原為醇類，分為ADH1和ADH2兩種類型[26]。相關研究發現，茶樹ADH基因能響應蟲害脅迫和機械損傷[27-28]。然而，在茶葉生產加工過程中，在搖青機械力處理下，茶葉中脂肪族類代謝物及相關基因表達模式的研究鮮見報道。

本研究以烏龍茶品種毛蟹為材料，為突顯搖青機械力的作用，設置等時間未搖青的攤放葉組，通過對離體茶樹鮮葉、搖青葉、攤放葉3 種不同葉態中脂肪族類代謝物質差異和LOX代謝途徑相關基因表達量的變化，分析搖青機械力對脂肪族類香氣形成與相關基因表達量的相關性，闡釋離體葉片中脂肪族類香氣物質形成的分子機理，為烏龍茶加工過程中香氣品質的形成研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料為種植于福建農林大學教學實驗茶場的烏龍茶品種毛蟹（Camellia sinensis cv. Maoxie）。采摘時間為2017年10月上旬，采摘標準為當年生長無病蟲害的一芽三四葉。

亞油酸（色譜純）、亞麻酸（色譜純） 美國Sigma公司；愈傷酸（標準品） 東京TCI公司；總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；反轉錄試劑盒及實時熒光定量使用試劑 日本Takara公司。

1.2 儀器與設備

6CYQT-60型搖青機、LGJ-25C型冷凍干燥機 北京四環生物制藥有限公司；超高效液相色譜儀 美國Waters公司；氣相色譜-質譜聯用儀 美國鉑金埃爾默公司；高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉的處理及分組

如圖2所示，在對鮮葉（XY）適度萎凋至含水率為72%后，將萎凋葉（1 000 g）均分為兩組，實驗組采用烏龍茶做青工藝對日光萎凋葉進行4 次搖青處理，每次搖青時間為3 min，期間每次攤放30 min，搖青桶轉速控制為40 r/min，做青過程總歷時為180 min，以鮮葉呈湯匙狀、綠葉紅邊明顯、花果香濃郁為標準做青葉（YQ）；同時在相同環境條件下設置對照組，即將另一組萎凋葉進行無搖青的攤放處理，作為等時的攤放葉（TF）。對每次處理的取樣進行3 次重復，用錫箔紙包好，采用液氮固樣法進行固樣，固樣后樣品放置于-70 ℃冰箱中保存備用。

圖2 烏龍茶加工過程中不同處理下的葉態Fig. 2 Turning-over and spreading of tea leaves during oolong tea processing

1.3.2 液相色譜-質譜測定不飽和脂肪酸及愈傷酸

液相色譜-質譜（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）條件參照文獻[29]。

樣品預處理：取冷凍干燥后樣品50 mg，加入500 μL試劑1（V（異丙醇）：V（水）：V（阿魏酸）＝2：1：0.002），加入2 顆預冷鋼珠，研磨2 min，-20 ℃放置20 min，冰浴中超聲30 min，加入1 mL氯仿，-20 ℃放置20 min，冰浴中超聲5 min，漩渦振蕩1 min，13 000 r/min離心5 min，取下層900 μL，揮干，1 mL甲醇超聲復溶1 min，樣品存放于-20 ℃待測。

采用BEH C8色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；氣簾氣35 psi；離子噴霧電壓-4 500 V；溫度350 ℃；離子源Gas1：30、Gas2：40；流動相B（10 mmol/L甲酸銨水溶液，含體積分數0.1%甲酸），流動相A（乙腈），采用等度洗脫。在Analyst軟件中采用默認參數對各MRM transition進行自動識別和積分。樣本濃度計算：將樣品分析物的質譜峰面積，代入線性方程中計算。

1.3.3 頂空萃取條件

頂空瓶加熱溫度80 ℃；取樣針溫度100 ℃；樣品瓶平衡溫度150 ℃；樣品平衡時間5 min；進樣時間1.0 min；加壓時間2.0 min；拔針時間0.5 min。

1.3.4 氣相色譜-質譜測定脂肪族類香氣成分

氣相色譜-質譜條件參照文獻[30]。采用VF-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。進樣口溫度：250 ℃，升溫程序：初始溫度40 ℃保持5 min，以2 ℃/min升至70 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃；載氣為氦氣，純度99.99%；質譜接口溫度250 ℃、傳輸線溫度120 ℃；離子方式EI源，離子源溫度200 ℃；檢測器電壓70 eV；采用全掃描模式，掃描范圍45～500 amu。測定數據由儀器自帶軟件進行分析處理，將茶葉樣品中脂肪族揮發性組分與NIST庫分析比較后，將峰面積大于1%的色譜峰作為有效觀測值，以歸一法確定各個物質的含量。

1.3.5 葉片中總RNA的提取及反轉錄

取0.5 g供試材料，利用RNAprep Pure Plant Kit提取樣品的總RNA，用1.2%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并檢測其吸光度及濃度，用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser將提取的總RNA反轉錄為cDNA。

1.3.6 qPCR檢測

以不同葉態的mRNA反轉錄成cDNA為模板，利用qPCR技術對不同葉態中的脂肪酸代謝途徑相關基因的表達進行分析。采用DNAMAN 6.0軟件設計茶樹ADH基因的qPCR引物（表1），以茶樹GAPDH為內標基因[31]。反應體系20 μL：1.0 μL 4×diluted cDNA，10 μL SYBR II，0.8 μL上、下游引物和7.4 μL ddH2O。PCR反應程序：95℃ 預變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環；72 ℃ 延伸10 min。采用2-△△Ct分別計算出相關基因的相對表達量[32]。

表1 茶樹中脂肪酸代謝途徑相關酶基因的引物Table 1 Primer sequences used for qPCR ampli fi cation of fatty acid metabolism-related genes in tea tree

1.4 數據統計與分析

顯著性分析采用SPSS 18.0軟件中的單因素方差分析最小顯著差異法，P＜0.05表示差異顯著。相關性分析采用SPSS 18.0軟件中雙變量相關性檢測，以Pearson相關系數衡量變量間的線性關系，顯著性采用雙側檢驗。

2 結果與分析

2.1 搖青機械力對不飽和脂肪酸的影響

圖3 不同葉態中亞麻酸（A）、亞油酸（B）的含量變化Fig. 3 Changes in linolenic acid (A) and linoleic acid (B) content in different kinds of tea leaves

作為LOX代謝途徑上重要的前體物質，亞麻酸和亞油酸在LOX的作用下氧化降解后生成脂肪族類揮發物質。LC-MS對樣品中靶向代謝物的檢測結果如圖3所示，鮮葉中的亞油酸（0.614 mg/g）和亞麻酸（0.227 mg/g）含量最高，在搖青機械力處理后含量驟減，分別降低了17.98%、21.52%，搖青葉中的亞麻酸和亞油酸的含量與鮮葉中的差異達顯著水平（P＜0.05），攤放處理下亞麻酸和亞油酸的含量分別降低了10.86%、20.71%，但攤放葉中僅亞油酸含量與鮮葉差異達顯著水平（P＜0.05）。

2.2 搖青機械力對脂肪族類香氣的影響

圖4 不同葉態揮發性組分的峰面積Fig. 4 Peak proportions of volatile components in different kinds of tea leaves

圖5 不同葉態C6醛類（A）、C6醇類（B）、葉醇酯類衍生物（C）的變化Fig. 5 Changes in C6 aldehyde (A), C6 alcohol (B) and leaf alcohol ester derivatives (C) in different kinds of tea leaves

實驗得到不同葉態不同揮發性物質的峰面積如圖4、5所示，從中篩選獲得脂肪族類香氣物質，根據物質差異分為C6醛、C6醇以及葉醇酯類衍生物3 類。

脂肪族醛類是茶葉清香氣味的重要成分之一，以C6醛類含量最為豐富，占茶葉芳香油含量的5%。鮮葉中測得C6醛主要有正己醛（22.53%）和青葉醛（29.46%）。與鮮葉相比，在機械力處理下的搖青葉中正己醛（4.82%）、青葉醛（10.57%）相對含量分別減少了78.60%和64.12%，而攤放葉中正己醛（6.46%）、青葉醛（13.44%）的相對含量也減少了71.33%和54.38%。

脂肪族醇類沸點低、易揮發，具有強烈的青草氣。在鮮葉中未測得相應的C6醇類物質，搖青葉中檢測到含有正己醇（1.20%）、反-2-己烯醇（0.48%）、反-3-己烯醇（0.30%）以及反-4-己烯醇（3.75%），而攤放葉中僅測得反-2-己烯醇（0.47%）。

脂肪族醇會進一步酯化成為具有水果清香的葉醇酯類物質。鮮葉僅測得乙酸葉醇酯（0.83%），在機械力作用下搖青葉中的葉醇酯類衍生物有乙酸葉醇酯（2.97%）、丁酸葉醇酯（3.15%）、己酸葉醇酯（1.06%）、苯甲酸葉醇酯（0.41%）、異戊酸葉醇酯（0.39%）及丁酸己酯（0.26%），攤放葉中測得的葉醇酯類衍生物有丁酸葉醇酯（0.29%）、己酸葉醇酯（0.22%）及異戊酸葉醇酯（0.14%）。機械力作用下，搖青葉中的葉醇酯類衍生物在類型和含量上都明顯增多，其中苯甲酸葉醇酯、丁酸己酯僅在搖青葉中測得，搖青葉中乙酸葉醇酯的含量相比鮮葉增多了257.83%，丁酸葉醇酯、己酸葉醇酯、異戊酸葉醇酯比攤放葉中分別增多了986.20 %、381.82 %以及178.57 %。

2.3 搖青機械力作用下脂肪酸代謝途徑相關基因的表達量

圖6 不同葉態中LOX（A)、HPL（B）及ADH（C）基因相對表達量的變化Fig. 6 Changes in relative expression levels of LOX (A), HPL (B) and ADH (C) genes in different kinds of tea leaves

不同葉態中脂肪代謝途徑相關基因的表達量如圖6所示。LOX1基因在搖青葉中相對表達水平最高，是鮮葉的9.62 倍，攤放葉中的表達水平其次，是鮮葉的4.44 倍。不同葉態的LOX1基因的表達量兩兩之間存在顯著性差異（P＜0.05）。LOX2和LOX3均是在攤放葉中表達水平最高，其次為搖青葉，攤放葉中LOX2、LOX3基因的表達水平分別是鮮葉的2.21 倍和5.97 倍，搖青葉中的表達水平則分別是鮮葉的1.39 倍和2.87 倍，不同葉態中LOX3基因兩兩間存在顯著性差異（P＜0.05），但LOX2基因僅攤放葉與鮮葉、搖青葉存在顯著性差異（P＜0.05），而鮮葉與搖青葉間并無顯著性差異。不同葉態中鮮葉的LOX4表達水平最高，其次為搖青葉，攤放葉中表達量最低。LOX4基因在搖青葉、攤放葉的表達量分別是鮮葉的94%和66%，同時不同葉態的LOX4基因的表達量兩兩之間也存在顯著性差異（P＜0.05）。不同葉態中的HPL基因以攤放葉表達水平最高，其次為搖青葉，攤放葉、搖青葉的HPL基因表達量分別是鮮葉的2.69 倍和1.68 倍，攤放葉中HPL基因表達水平與搖青葉、鮮葉間存在顯著性差異（P＜0.05），但搖青葉與鮮葉間不存在顯著性差異。不同葉態的ADH基因以搖青葉的表達量最高，其次為鮮葉，攤放葉最低，搖青葉、攤放葉的ADH基因表達水平分別是鮮葉的2.37 倍和1.01 倍，搖青葉中ADH基因與鮮葉、攤放葉間存在顯著性差異（P＜0.05），但攤放葉與鮮葉間不存在顯著性差異。

2.4 搖青機械力對愈傷酸含量的影響

圖7 不同葉態中愈傷酸的含量變化Fig. 7 Change in traumaic acid content in different kinds of tea leaves

除C6醛類物質外，LOX/HPL系統的產物還有12-氧代-9(Z)-月桂烯酸，之后又會在十二酰基CoA異構酶（EC 5.3.3.8）的作用下最終形成反式-2-十二碳烯二酸，即愈傷酸。愈傷酸是天然存在于植物中的單元不飽和二羧酸，它能夠響應植物的愈傷反應，而介導相關基因的轉錄。通過LC-MS檢測不同葉態的愈傷酸含量，結果如圖7所示，愈傷酸含量：鮮葉＞攤放葉＞搖青葉，這說明在葉片失水過程中愈傷酸含量在減少，但搖青處理后愈傷酸的含量與鮮葉間的差異達顯著水平（P＜0.05），而攤放處理則未達到顯著水平。

2.5 搖青機械力作用下脂肪族類代謝物含量與相關基因表達量間的相關性分析

脂肪族類代謝物含量與脂肪族代謝途徑中LOX1-4、HPL及ADH基因的相關性分析如表2所示。結果表明，不同葉態中LOX1基因的表達水平與測得的脂肪族類香氣物質含量均存在相關性，其中與青葉醛、正己醛含量極顯著負相關（P＜0.01），與正己醇、反-3-己烯醇、反-4-己烯醇、丁酸葉醇酯、己酸葉醇酯、苯甲酸葉醇酯、異戊酸葉醇酯及丁酸己酯含量間均存在極顯著正相關性（P＜0.01），與反-2-己烯醇、乙酸葉醇酯間存在顯著性正相關性（P＜0.05）。ADH基因的表達水平與正己醇、反-3-己烯醇、反-4-己烯醇、乙酸葉醇酯、丁酸葉醇酯、己酸葉醇酯、苯甲酸葉醇酯、以及丁酸己酯間存在極顯著正相關（P＜0.01），但與青葉醛、正己醛以及反-2-己烯醇之間不存在顯著相關性。LOX4基因的表達水平與正己醛、青葉醛含量存在顯著正相關性（P＜0.05），同時與反-2-己烯醇含量存在顯著負相關性（P＜0.05）。LOX3基因的表達水平與反-2己烯醇間存在顯著正相關性（P＜0.05），而LOX2和HPL基因表達量則與測得的所有脂肪族類香氣物質含量均不存在顯著相關性。亞油酸、亞麻酸含量僅與ADH基因表達量間存在顯著負相關性（P＜0.05），而愈傷酸含量與LOX1、LOX3基因表達量間存在極顯著負相關性（P＜0.01）。

表2 脂肪族類代謝物含量與脂肪酸代謝途徑相關基因表達量間的相關系數Table 2 Correlation coef fi cients between aliphatic aroma and relative expression levels of fatty acid metabolism-related genes

3 討 論

3.1 搖青機械力對脂肪族類代謝物的轉變

隨著鮮葉的離體，LOX/HPL系統開始氧化降解鮮葉中不飽和脂肪酸，搖青機械力進一步加重離體葉的損傷程度，在搖青葉中C6醛類較攤放葉中轉化降低更為明顯，且亞油酸和亞麻酸含量均較低，這說明搖青機械力的刺激促進了LOX/HPL系統的活性，Qian Xu等[33]的研究發現，葡萄LOX/HPL代謝通路上相關基因的表達，能顯著促進果實中綠葉揮發物質（green leaf volatile，GLVs）的轉變。同時，這種損傷脅迫下促使了ADH基因表達水平的上調，并豐富了C6醇類及葉醇酯類衍生物，C6醇類在搖青葉中以正己醛和反式己烯醇為主，反式己烯醇的形成說明搖青機械力可能激活了異構因子，C6醇類物質由順式向反式轉變，這種異構作用促使青葉中強烈的青氣香轉變為柔和的怡人清香[34]，即完成低級的脂肪族類GLVs向果酯類香型轉變。葉醇酯類物質是C6醇類物質在AAT作用下葉醇類物質的衍生物，配體的結合使化學性質更加穩定。測得的葉醇酯類及其衍生物普遍具備彌散性清新果香[35]，鮮葉和攤放葉中醇酯類物質在組分和含量上都遠低于搖青葉，這表明了搖青機械力可能激活了AAT的活性，促使酯化反應發生。以失水為主的攤放葉受到的外界損傷較小，離體鮮葉中13-LOX亞族中的LOX2、LOX3基因及HPL基因大量表達，這說明酶系統在氧化裂解不飽和脂肪酸的同時，生成的愈傷酸可能響應離體脅迫，而攤放過程中完成自我修復，從而抑制了LOX/HPL通路的下游酶活性。

3.2 LOX /HPL代謝通路基因的表達差異

LOX1基因在不同葉態中表達水平與所有脂肪族類香氣存在顯著相關性，LOX2、LOX3基因表達量變化趨勢基本一致，這可能是因為二者同屬13-LOX亞族，但LOX1、LOX4基因表達差異卻較大，尤其與C6醛類的相關性完全相反，造成這種現象的原因可能是13-LOX亞族基因核酸序列間相似度較高，而9-LOX亞族間基因相似度較低，這在一定程度上表明9-LOX亞族基因所編碼的蛋白在進化過程中出現了明顯的亞功能化，同時對茶樹中LOX1基因編碼的蛋白并非完全屬于9-LOX亞族[36]，該基因編碼的蛋白是一類具備雙裂解位點的9/13-LOX蛋白，Liu Shou’an等[37]驗證茶樹中LOX1基因的性征，并發現在該基因在茶花衰老過程中表達水平明顯上調。Fu Xiumin等[38]研究了不同光質條件下，LOX基因的表達模式。Gui Jiadong等[39]認為烏龍茶的花果香與做青過程中青葉LOX活性上升有關。王晶[9]則研究了烏龍茶加工過程中LOX活性和香氣間的變化。這或許暗示著茶樹LOX基因家族中具備多裂解位點的家族成員，對茶葉加工過程中的香氣形成有著積極的影響。大量研究表明植物應對外界損傷時LOX代謝途徑起主要作用的是13-LOX亞族的基因[40-42]，而LOX2、LOX3基因在攤放葉中應對離體脅迫時候的大量表達正契合了這一觀點，同時也說明搖青機械力作用的二次損傷，雖不能上調13-LOX亞族基因的表達，但卻能顯著誘導上調9/13-LOX亞族中LOX1基因的表達。同時ADH基因的表達水平和葉醇酯類衍生物含量呈正相關，表明代謝途徑下游的ADH在機械力脅迫下對脂肪香氣的形成有積極的作用。辛肇軍等[28]從龍井43中克隆了CsADH1序列，發現并驗證了CsADH1基因的表達受外界機械損傷、茉莉酸和水楊酸的誘導。

4 結 論

鮮葉中以亞麻酸和亞油酸為代表的不飽和脂肪酸，因采摘造成了第一次的損傷脅迫，激活了LOX/HPL系統，LOX與HPL將不飽和脂肪酸氧化降解為GLVs類物質。搖青處理誘導了LOX1和ADH基因的轉錄，C6醛類物質被還原為C6醇類物質，在機械力反復作用的搖青葉中，二次損傷在間歇反復進行，自身修復愈傷能力在做青后期已經逐步散失，離體葉片中的愈傷酸不足以修復損傷，而這正激活下游的ADH、AAT，促使搖青葉中豐富的脂肪族類及其他香氣物質的形成；但攤放過程中形成愈傷激素，失水的同時完成因采摘而形成第一次損傷的自我修復，并終止了下游代謝的進行，所以，未經搖青的綠茶以綠葉的清香為主，而搖青工藝則賦予了烏龍茶豐富的花果香（圖8）。

圖8 離體鮮葉脂肪酸代謝與綠茶、烏龍茶香氣形成的關系Fig. 8 Relationship between fatty acid metabolism in vitro in tea leaves and the aroma formation of green tea and oolong tea