植物乳桿菌通過調節腸道短鏈脂肪酸水平緩解代謝綜合征

朱廣素，王 剛,*，王園園*，馬方勵，趙建新，張 灝，陳 衛

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122 ；2.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510623 ）

高能量的飲食可能導致營養攝入與消耗的失衡，從而引發代謝綜合征，主要癥狀包括高血糖、高血脂、胰島素抵抗及肥胖等一系列代謝紊亂[1-2]。能量攝入過度破壞了腸道菌群的組成及其多樣性[3]，導致腸道內Firmicutes/Bacteroidetes的比例下降[4]。益生菌主要包括雙歧桿菌屬和乳桿菌屬，已被證實可調節腸道菌群、抑制有害菌的生長、增強腸道免疫力，因此，通過補充益生菌等微生態制劑緩解慢性炎癥引發的代謝綜合征成為一種新的途徑[5-7]。

建立穩定的代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）動物模型是開展MS發病機制及臨床治療研究的重要基礎。目前，文獻報道的MS造模方法主要分為遺傳型、飲食誘發型和藥物誘導型[8]。考慮到遺傳型和藥物誘導型MS模型的發病進程，與人類MS的自然病程差異較大，且其發病特征及機制有所不同，而長期高熱量飲食導致的能量失衡是MS的主要誘因，因此高糖高脂（high-fat and high-sucrose，HFHS）飲食誘發型MS模型更能客觀體現自然狀態下環境因素對MS的影響，且使用最為廣泛[9-11]。對于飲食導致的MS動物模型，大多數研究通過在實驗周期內的不同時間節點，檢測血清中與代謝相關指標（如血糖含量、胰島素含量、葡萄糖耐量、血脂四項等參數）來判定造模是否成功[12-13]。

腸道微生物種群發酵不易消化多糖形成的產物為短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）[14]，主要包括乙酸、丙酸和丁酸（物質的量之比約3∶1∶1），占所有SCFAs總量的95%以上[15]。近年來，研究表明SCFAs可以促進腸道蠕動、增加營養物質的吸收，改善胰島素抵抗引發的肥胖[16]。SCFAs受體GPR43能夠抑制脂肪組織的脂肪積累，促進肝臟等其他組織的脂質代謝，維持血糖平衡[17]；此外，它還能調節機體下丘腦中樞減少食欲[18]，增強胰島β細胞的功能[19]，改善胰島素敏感性。小腸L細胞積累的SCFAs，可以促進胰高血糖素樣肽-1（glucagonlike peptide-1，GLP-1）的分泌，增加飽腹感以維持機體血糖-胰島素的穩態[20]。

本研究團隊前期采用MiSeq高通量測序技術，分析了植物乳桿菌干預對MS大鼠腸道菌多樣性和物種組成的影響，發現產SCFAs的細菌種屬在高脂飲食大鼠體內發生顯著變化。基于上述研究結果，本研究用高糖高脂飲食的大鼠模型，對大鼠血清中血糖血脂等代謝指標和肝臟抗氧化能力進行檢測，對肝臟、十二指腸及胰島進行組織病理學分析，同時測定大鼠糞便中的SCFAs含量，探討植物乳桿菌對MS的緩解機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

實驗動物為SD雄性大鼠，購于上海斯萊克公司，使用許可證號：SYXK（蘇）2016-0011。適應一周后，隨機分為8 組。飼養條件為：4 只一籠，同室飼養，自由飲食飲水，溫度為（22±2）℃，相對濕度為（55±5）%，12 h光暗交替。實驗用基礎飼料和高糖高脂飼料的配方表見表1。

表1 動物飼料配方Table 1 Compositions of experimental diets

實驗用菌株均來自于江南大學食品生物技術中心菌種保藏中心，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）為對照菌株。菌株具體信息及來源見表2。

表2 菌株信息表Table 2 Information about the strains tested in this study

MRS培養基 青島海博生物技術有限公司；葡萄糖廣西梧州制藥股份有限公司；羅格列酮片 成都恒瑞制藥有限公司；高糖高脂飼料 北京華阜康生物科技有限公司；葡萄糖（glucose，Glu）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測試劑盒 南京威特曼生物科技公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成生物技術公司；胰島素檢測試劑盒 上海依科賽生物制品有限公司；其他常用試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；大容量冷凍離心機、Multiscan Go多功能酶標儀 美國Thermo公司；高溫高壓滅菌鍋 日本SANYO公司；恒溫恒濕培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；高通量組織研磨儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Pannoramic MIDI組織切片掃描儀 匈牙利3DHISTECH公司；氣相色譜-質譜聯用（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將菌株接種于的MRS培養基中，37 ℃活化兩代后用于制備動物實驗所需菌懸液。將培養好的菌液以8 000×g離心20 min，無菌磷酸鹽緩沖液清洗菌體2 遍，調整活菌數為5×1010CFU/mL，用質量分數30%的蔗糖溶液重懸后，于-80 ℃保藏備用。灌胃前用無菌水稀釋10 倍。

1.3.2 動物分組及處理條件

動物實驗方案見表3，每組8 只SD大鼠，處理12 周。辛伐他汀和羅格列酮分別作為降血脂和降血糖的陽性對照。

表3 動物實驗方案Table 3 Grouping of experimental animals

1.3.3 樣品收集

實驗結束前，收集大鼠糞便樣品，用于測定SCFAs；腹腔注射200 mg/kgmb的戊巴比妥鈉溶液麻醉后，取血，解剖摘取臟器。血液在4 ℃、3 000×g條件下離心10 min，少量多次吸取上清液，置于-80 ℃凍存備用。收集肝臟、小腸、胰腺組織，生理鹽水漂洗后，置于甲醛溶液中固定，用于組織病理分析。

1.3.4 血液生化指標的檢測

按照試劑盒說明書的方法檢測血清中Glu、TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。

1.3.5 肝臟抗氧化指標的檢測

按照試劑盒說明書的方法檢測肝臟中SOD、CAT活力及MDA含量。

1.3.6 腹腔注射葡萄糖耐量測定

在第12周實驗結束前，禁水禁食5 h，腹腔注射2 g/kg的葡萄糖溶液，在0、30、60、120 min時檢測血糖濃度。葡萄糖耐量的大小由糖耐量曲線下面積（area under curve，AUC）表示。

1.3.7 病理組織學分析

肝臟、胰腺和十二指腸的病理組織學分析參考李向菲[21]的方法：組織樣品經固定、洗滌后，用梯度濃度的乙醇溶液脫水，石蠟包埋后切成5 μm厚度的片段，蘇木精-伊紅染色后用切片掃描儀進行觀察，拍照記錄。

病理學具體評分標準如下。1）肝脂病變評分方法：根據脂變細胞在肝小葉內的范圍，依次定量為0～4 分。0 分（基本正常）；0.5 分（輕微、極少量）脂肪變性的肝細胞細胞數占肝小葉內細胞數小于12%；1 分（輕度、少量），脂變的肝細胞數約占12%～25%；2 分（中度、中等量），脂變的肝細胞數約占25%～50%；3 分（重度、多量），脂變的肝細胞數約占50%～75%；4 分（極重度、大量），脂變的肝細胞數大于75%。2）其他評分方法：其他病變根據由輕到重的程度，依次定量為0～4 分：輕微或極少量為0.5 分，輕度或少量為1 分，中度或較多為2 分，重度或多量為3 分，極重度或大量為4 分，正常為0 分。

1.3.8 糞便中SCFAs的測定

參照Samuel等[22]的研究方法，用GC-MS的方法檢測大鼠糞便中主要SCFAs（乙酸、丙酸、丁酸）的含量，GC-MS的具體條件參照Wang Gang等[23]的研究。方法如下：取50 mg糞便樣品，加入500 μL飽和NaCl溶液充分混勻；加入20 μL質量分數10%硫酸溶液進行酸化后，加入800 μL乙醚振蕩，4 ℃、18 000×g離心15 min，取上清液，加0.25 g無水硫酸鈉，充分振蕩后再次離心（4 ℃、18 000×g，15 min），吸取上清液加入氣相瓶中，進行GC-MS分析。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌對大鼠血糖-胰島素穩態的影響

與NC組相比，HFHS組大鼠表現出一系列一定水平的代謝紊亂，包括空腹血糖和空腹胰島素水平均顯著增加，對葡萄糖的清除能力下降，導致大鼠血糖-胰島素穩態失衡。

圖1 植物乳桿菌對大鼠空腹血糖濃度（A）和空腹胰島素質量濃度（B）的影響Fig. 1 Effect of L. plantarum on fasting blood glucose (A) and fasting insulin (B) levels

圖2 植物乳桿菌對MS大鼠葡萄糖耐量（A）和AUCglucose（B）的影響Fig. 2 Effect of L. plantarum on glucose tolerance (A) and AUCglucose (B)in MS rats

如圖1所示，補充3 株植物乳桿菌能夠在一定程度上緩解高糖高脂飲食引發的空腹血糖和空腹胰島素水平的升高，其中QS6-12表現出較好的降血糖能力，而CCFM591能夠較顯著地改善胰島素抵抗。由葡萄糖耐量曲線（圖2A）可以發現，腹腔注射葡萄糖后，HFHS飲食的大鼠血糖濃度在30 min時急速上升，在接下來的90 min緩慢下降，但仍高于NC組；補充菌株CCFM591和ZS2058顯著抑制了血糖濃度的升高，且在120 min時使血糖濃度下降至與NC組水平相當。計算糖耐量曲線下面積（AUCglucose）（圖2B）發現，HFHS組的AUCglucose明顯高于其余各組，LGG組的AUCglucose較3 株植物乳桿菌更低，RH緩解糖耐量異常效果最為明顯，與NC組無統計學差異。

2.2 植物乳桿菌對大鼠血脂指標的影響

圖3 植物乳桿菌對MS大鼠血脂指標的影響Fig. 3 Effect of L. plantarum on blood lipids in MS rats

如圖3所示，與NC組相比，HFHS組大鼠血清中TC、TG和LDL-C濃度顯著升高，HDL-C濃度下降。補充菌株ZS2058顯著降低了血清中TC和LDL-C的濃度；補充菌株QS6-12使TG濃度明顯下降；補充植物乳桿菌對大鼠血清中HDL-C濃度影響較小；藥物RH對高糖高脂飲食大鼠的血脂紊亂有較好的緩解作用。

2.3 植物乳桿菌對大鼠肝臟抗氧化指標的影響

圖4 植物乳桿菌對MS大鼠肝臟氧化應激的影響Fig. 4 Effect of L. plantarum on liver oxidative stress in MS rats

如圖4所示，各組大鼠肝臟中CAT活力無顯著差異，HFHS飲食導致大鼠肝臟中MDA含量升高、SOD活力下降；補充菌株QS6-12能夠顯著提高肝臟中SOD活力，與LGG效果相當。補充植物乳桿菌均能降低肝臟MDA的含量。

2.4 植物乳桿菌對MS大鼠組織形態的影響

圖5 大鼠肝臟組織的病理學分析（200×）Fig. 5 Histopathological observation of hematoxylin-eosin stained liver sections (200 ×)

圖6 大鼠小腸組織的病理學分析（100×）Fig. 6 Histopathological observation of hematoxylin-eosin stained intestinal tissue sections (100 ×)

圖7 大鼠胰腺組織的病理學分析（200×）Fig. 7 Histopathological observation of hematoxylin-eosin stained pancreatic tissues (200 ×)

圖8 大鼠肝臟（A）、十二指腸（B）和胰腺（C）切片的組織學評分Fig. 8 Histopathological scores of liver (A), duodenum (B) and pancreatic tissues (C)

各實驗組大鼠肝臟、十二指腸和胰腺的病理學切片如圖5～7所示，結合組織學評分（圖8）可以看出，HFHS飲食導致大鼠肝臟、十二指腸和胰腺均出現較嚴重的損傷，包括肝細胞空泡變性、纖維細胞增生，有早期纖維化的形態學表現；小腸病變主要在絨毛，表現出絨毛變寬、間質水腫或巨噬細胞輕度增生；內分泌部胰島細胞變性、胰島纖維血管增生、數目減少等。植物乳桿菌灌胃對肝臟病變無顯著改善作用；然而，對十二指腸和胰島的病變均表現出緩解作用，與NC組無顯著差異。

2.5 植物乳桿菌對SCFAs的調控

圖9 植物乳桿菌對大鼠糞便乙酸（A）、丙酸（B）和丁酸（C）含量的影響Fig. 9 Effect of L. plantarum on levels of faecal acetate (A),propionate (B) and butyrate (C)

進一步對大鼠糞便的SCFAs進行分析，結果如圖9所示。HFHS飲食導致糞便中乙酸、丙酸和丁酸的含量顯著降低；補充菌株CCFM591使糞便中乙酸和丁酸的含量顯著升高，且高于藥物RH的效果，與菌株LGG的改善作用相當；除菌株ZS2058外，其他乳桿菌均能提高大鼠糞便中丙酸的含量，LGG組大鼠糞便中丙酸含量最高。

3 討 論

胰島素抵抗及其相關疾病的發生發展與高糖高脂飲食導致的系統性低水平炎癥密不可分，近年來，越來越多的研究證實膳食補充益生菌可以緩解MS[7,24-25]，但其在改善飲食誘導的代謝紊亂中發揮的具體作用仍不明確。本研究利用高糖高脂飲食誘導的MS大鼠模型，通過對大鼠血糖血脂、抗氧化能力進行檢測，結合病理組織學及糞便SCFAs的分析，評價植物乳桿菌對MS的緩解作用。

通常情況下，胰腺和肝臟共同作用實現能量的轉換，從而維持血液中葡萄糖和胰島素的穩態，使機體發揮正常功能[21]；高糖高脂飲食導致機體能量過剩，血糖和胰島素之間的穩態失衡。Chen Jinjin等[26]的研究發現，補充長雙歧桿菌能夠降低空腹血糖的含量，提高胰島素的敏感性，從而緩解高脂飲食導致的MS；Hsieh等[27]的研究表明，灌胃羅伊氏乳桿菌GMNL-263可降低體質量和血液中胰島素的含量，改善高果糖飲食引發的胰島素抵抗；Kim等[28]通過高脂飲食的大鼠模型，發現鼠李糖乳桿菌LGG可通過減少腹部脂肪的產生，增強胰島素的敏感性。與前人的研究一致，本研究發現高糖高脂飲食的大鼠表現出一系列的代謝紊亂，包括空腹血糖和空腹胰島素水平均顯著增加，對葡萄糖的清除能力下降，導致大鼠血糖-胰島素穩態失衡；補充3 株植物乳桿菌能夠在一定程度上緩解上述癥狀，其中菌株QS6-12表現出較好的降血糖能力，而菌株CCFM591則在改善胰島素抵抗方面顯示出更明顯的效果。葡萄糖耐量實驗是一種葡萄糖負荷實驗，用以了解胰島β細胞功能和機體對血糖的調節能力；菌株CCFM591和ZS2058能夠較顯著地緩解口服葡萄糖導致的血糖濃度異常升高，最終維持機體血糖-胰島素之間的穩態。

高血脂是MS的并發癥之一，研究表明，血清中TC和LDL-C的水平過高將會增加心血管疾病的患病風險[29]，本研究結果證實，高糖高脂飲食導致大鼠血清中TC、TG和LDL-C的含量顯著升高，HDL-C含量下降；補充菌株ZS2058顯著降低了血清中TC和HDL-C的濃度，但對HDL-C濃度影響較小，而菌株CCFM591對血脂紊亂無顯著的改善作用，這說明不同的植物乳桿菌在控制血糖血脂代謝方面可能有著不同的調節模式，且血糖調節與血脂調節的機制也存在差異。Yang Bo等[30]曾報道菌株ZS2058具有產共軛亞油酸的能力，已知共軛亞油酸具有調節血液甘油三酯水平、防止動脈粥樣硬化的功能，本研究結果再次證明菌株ZS2058具有調控高糖高脂飲食導致的血脂異常的潛力。此外，也有大量的報道證明乳酸菌在血糖血脂調節方面具有潛在的應用價值，如Xie Ning等[31]通過建立高膽固醇大鼠模型，同樣證實了植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌能夠減少血清中TC和LDL-C的含量。Li Chuan等[32]利用高血脂大鼠模型發現，植物乳桿菌NCU116降低了血清中TC、TG和LDL-C水平，提高了HDL-C水平，顯著改善了血脂的異常。本研究代謝指標的異常主要是血糖和血脂的變化，表現為代謝紊亂早期的癥狀；考慮到造模時間原因，該模型導致的代謝失調仍處于MS的前期[12]。

多項基于動物模型的研究表明，補充益生菌能緩解高脂飲食引起的機體氧化應激和炎癥反應。Yadav等[33]通過高果糖大鼠模型，發現嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌能緩解血脂異常和氧化應激損傷；干酪乳桿菌Zhang能夠降低高脂飲食大鼠的MDA水平，提高SOD和GPx的活力，改善大鼠肝臟的抗氧化能力[34]；同樣的，本研究顯示補充植物乳桿菌能夠降低MDA水平，恢復SOD活力，但考慮到造模時間較短，氧化應激水平較低，植物乳桿菌對氧化應激緩解尚不夠顯著。

SCFAs能夠通過AMPK依賴途徑參與調節肝臟的脂質代謝等功能。Demigné等[35]通過分離大鼠的肝細胞發現，乙酸是肝臟脂肪合成的底物，而丙酸能夠抑制脂質生成。本研究表明，藥物羅格列酮能夠顯著改善大鼠肝臟的病變，且糞便中SCFAs含量較高；但植物乳桿菌對肝臟病變無顯著緩解作用。基于肥胖和2型糖尿病的動物模型研究，表明補充乙酸、丙酸和丁酸能夠降低肝臟脂肪堆積；但至今仍缺乏SCFAs改善肝臟代謝的臨床研究。高脂飲食會導致胰島細胞病變，與Wang Gang等[23]的研究結果一致，補充植物乳桿菌能夠改善胰島細胞空泡變性和間質纖維血管增生，其中菌株CCFM591的效果最顯著。

根據SCFAs參與外周組織的功能調解可以推測，SCFAs與機體的葡萄糖-胰島素穩態密切相關[36]。乙酸在腸道末端與短鏈脂肪酸受體GPR41、GPR43共同作用，調節能量攝入和血糖穩態[17]；而丙酸和丁酸可誘導小腸糖異生，增強交感神經的活性，從而改善葡萄糖和能量的穩態[37]。Aoki等[38]通過MS動物模型，證實了動物雙歧桿菌GLC2505能夠通過上調乙酸含量，降低內臟脂肪的積累，增加大鼠葡萄糖耐受能力，最終緩解MS；Yadav等[39]通過給肥胖小鼠灌胃復合益生菌劑VSL#3，發現補充益生菌可以提高乙酸水平，促進GLP-1的分泌，降低血糖水平從而緩解糖尿病；Venter等[40]通過人體研究發現，連續7 周補充丙酸能夠降低空腹血糖和胰島素增量。與上述研究結果一致，綜合3 種SCFAs的變化，補充菌株CCFM591能使糞便中乙酸、丙酸和丁酸的含量均得到較為顯著的升高，從而表明該菌可能通過對SCFAs的調節發揮了降血糖作用，改善了代謝紊亂大鼠的葡萄糖穩態。而其余乳桿菌對部分SCFAs的調節很可能也參與了對MS的緩解。

4 結 論

本研究通過高糖高脂飲食的動物模型，發現高糖高脂飲食引發了一系列代謝紊亂，植物乳桿菌，尤其是菌株CCFM591可有效調控腸道內3 種SCFAs的水平，這與其降低血脂并調節大鼠血糖-胰島素穩態，減輕胰島和小腸組織病變從而緩解大鼠MS的作用相吻合。此外，本研究也為通過膳食補充益生菌來靶向調控SCFAs、緩解機體代謝紊亂提供了新思路。