鐵皮楓斗多糖對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

羅 群，沈先榮*，侯登勇，何 穎，蔣定文，王慶蓉，陳 偉

（第二軍醫大學海軍醫學研究所，上海 200433 ）

肝臟是體內消化、代謝、排泄、解毒和免疫等過程的重要器官[1]，其結構和功能復雜，易受病原體、有毒物質、免疫病理等累及。酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是長期大量飲酒所致的肝臟疾病，近年來ALD的發病率呈逐年上升趨勢，酒精已成為繼病毒性肝炎后導致肝損害的第二大病因[2]。急性酒精性肝損傷是ALD的早期表現，酒精及其代謝產物會引起脂質代謝紊亂、氧化應激及細胞凋亡等，對肝組織造成損害[3-4]。

中草藥多糖具有抗氧化功能，可抑制脂質過氧化所致的肝細胞直接損傷，還可以調節脂質代謝、抑制脂肪肝的發生[5-6]。鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛的新鮮或干燥莖，鮮鐵皮石斛剪去部分須根后，經炒制扭成螺旋形，烘干后成品習稱鐵皮楓斗。據《中國藥典》中記載，“石斛，性寒，味甘、淡、微咸，人胃、腎經，具有益胃生津，滋陰清熱的功效”[7]。多糖是鐵皮石斛的主要有效成分，能夠清除自由基，具有抗氧化活性[8-10]，可以調節機體免疫力[11-12]，防治亞健康，減少疾病的產生，抑制腫瘤，延緩衰老[13-14]。袁慧琦等[15]研究發現鐵皮石斛對酒精性肝損傷具有一定的治療作用，而其作用機制可能是通過上調肝臟組織中凋亡調節蛋白Bcl-2的表達實現。聶春艷等[16]研究表明霍山石斛水溶性多糖可在血清肝功能、脂質代謝以及肝組織酒精代謝酶和抗氧化體系等方面共同干預和恢復酒精性肝損傷。黃靜等[17]研究發現霍山石斛多糖對CCl4致小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用，其保護機制可能與清除自由基、抑制脂質過氧化、抑制腫瘤壞死因子-α表達有關。本實驗通過水提法提取鐵皮楓斗多糖，觀察其對急性酒精性肝損傷動物的血液及肝組織相關生化指標的影響，并檢測肝組織病理變化，研究鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性ICR小鼠（體質量18～22 g）由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（滬）2013-0016。

鐵皮楓斗由上饒致誠實業有限公司提供，經鑒定為蘭科植物鐵皮石斛的干燥莖。取鐵皮楓斗水提物，溶解于蒸餾水中作為受試藥，4 ℃冷藏保存。

聯苯雙酯滴丸（批號13010102，溶解于蒸餾水中作為陽性試劑，4 ℃冷藏保存） 北京協和藥廠；谷草轉氨酶（aspartate amino transferase，AST）、谷丙轉氨酶（aspartate transaminase，ALT）、甘油三酯（triglyceride，TG）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒 南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；旋轉蒸發器 上海申勝生物技術有限公司；759型紫外分光光度計、759型紫外-可見分光光度計 上海奧普勒儀器有限公司；酶標儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮楓斗多糖的提取

稱取20 g鐵皮楓斗，在中藥粉碎機中粉碎后，加入裝有1 000 mL蒸餾水的圓底燒瓶中，75 ℃水浴中攪拌加熱4.5 h，過濾離心除渣后取得水提液。將水提液用鹽酸調至pH值為3，利用等電點沉淀法去除雜蛋白，4 ℃靜置過夜后，采用500 mL離心管11 680×g離心30 min，取上清液，加入4 倍體積的體積分數95%乙醇溶液，4 ℃靜置過夜，再采用500 mL離心管11 680×g離心30 min，得沉淀。在鼓風干燥箱中于40 ℃條件下干燥至恒質量，得到水提固形物3.28 g（白色粉末狀），得率為16.4%。采用硫酸-蒽酮比色法測定固形物中的總糖質量分數為81.0%。

1.3.2 動物分組與給藥

將小鼠隨機分為6 組，每組10 只，設空白對照組、模型組、陽性對照組（灌胃150 mg/kg mb聯苯雙酯）及鐵皮楓斗多糖高、中、低劑量組。高、中、低劑量以《中華人民共和國藥典（一部）》石斛干品的人體（體質量以60 kg計）推薦攝入量（6～12 g/d）中值（10 g/d）的5、10、30 倍為依據，計算出每組小鼠的給藥劑量。依據小鼠體質量，各劑量組的每日給藥量分別為：高劑量組0.05 g/（10 g mb）、中劑量組0.016 7 g/（10 g mb）、低劑量組0.008 3 g/（10 gmb）。石斛多糖組與陽性對照組每日按10 mL/kg劑量灌胃小鼠一次，空白對照組和模型組小鼠給予相同體積蒸餾水，每天灌胃1 次，連續灌胃14 d，按體質量調整灌胃量。末次給藥2 h后，除空白對照組外，其余各組按12 mL/kg一次性灌胃體積分數50%乙醇溶液，禁食不禁水，12 h后再灌胃一次，空白對照組給予相應體積蒸餾水，最后一次灌胃后12 h處死小鼠。

1.3.3 血液指標測定

小鼠摘眼球取血，血細胞計數儀測定紅細胞（red blood cell，RBC）含量、紅細胞比容（hematocrit，HCT）、紅細胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）、白細胞（white blood cell，WBC）含量和血紅蛋白（hemoglobin，HGB）質量濃度；血液靜置后1 040×g離心10 min分離血清，按照試劑盒說明測定血清TG濃度及ALT、AST活力。

1.3.4 肝組織指標測定

取血后處死小鼠，迅速取出肝臟，稱質量，測定動物肝臟指數（肝臟指數/（mg/g）＝肝臟質量/mg/體質量/g）；另精確稱取小鼠肝臟左葉相同部位組織100 mg，生理鹽水制備質量分數10%肝勻漿，530×g低溫離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明測定肝組織TG濃度、SOD、GSH-Px活力，二喹啉甲酸法測定蛋白含量。

取小鼠肝臟左葉處小塊組織，用10%福爾馬林試劑固定，常規脫水、石蠟包埋、蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色，制成切片，用普通光學顯微鏡觀察肝細胞變性程度、壞死及炎癥改變等。

1.4 數據統計分析

實驗數據以 ±s表示。組間差異分析采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 對急性酒精性肝損傷小鼠血相指標的影響

表1 鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損傷小鼠血相的影響（n= 10）Table 1 Effects of Dendrobium candidum polysaccharides on hemogram in mice with acute alcoholic liver injury (n= 10)

如表1所示，由于大量攝入酒精后，小鼠發生炎癥反應，同時也會發生失水，與空白對照組相比，模型組小鼠血液的紅細胞和白細胞含量都顯著增高（P＜0.05），給藥組中，各劑量組的紅細胞含量相對于模型組都顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），相對于空白對照組無顯著性差異；各劑量組白細胞含量相對于模型組都有下降，而中劑量組的白細胞含量相對于模型組顯著降低（P＜0.05）。

2.2 對急性酒精性肝損傷小鼠血清指標的影響

脂質過氧化作用是酒精對肝損傷的一種主要方式[18]，大量飲酒會激活氧分子，產生氧化自由基，導致肝細胞膜的脂質過氧化，改變肝細胞膜的結構和功能。ALT和AST是肝細胞內兩種重要的轉氨酶，小鼠在急性酒精性肝損傷時，肝細胞中的ALT和AST會進入血液中，使血清ALT和AST水平升高[19]。

表2 鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損傷小鼠血清TG、ALT和AST水平的影響（n=10）Table 2 Effects of Dendrobium candidum polysaccharides on the level of TG, ALT and AST in serum of alcohol-treated mice (n= 10)

如表2所示，模型組小鼠血清中TG、ALT、AST的水平都顯著高于空白對照組（P＜0.05，P＜0.01），可見，急性酒精性肝損傷模型建模成功。各劑量組小鼠血清中的TG濃度都顯著低于模型組（P＜0.05），高劑量組中小鼠血清ALT活力顯著低于模型組（P＜0.05），低劑量組中小鼠血清A S T活力顯著低于模型組（P＜0.05），實驗結果表明鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損傷具有防護作用。

2.3 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指數的影響

肝臟受到酒精性損傷時會出現肝細胞呈水樣變性而腫大；在出現脂質代謝紊亂時，肝細胞內出現脂肪堆積，導致脂肪變性，使肝細胞體積腫大，質量增加；而當肝細胞微管受損，分泌功能障礙時，會導致分泌性蛋白貯留，出現氣球樣變性，肝臟指數升高。肝臟受到損傷，肝臟指數會發生明顯變化，肝臟指數可反映肝臟的病變情況。

表3 鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指數的影響（n= 10）Table 3 Effects of Dendrobium candidum polysaccharides on liver index of alcohol-treated mice (n= 10)

如表3所示，模型組小鼠的肝臟指數極顯著高于空白對照組（P＜0.01），說明模型組酒精性肝損傷嚴重，造模成功。各劑量組小鼠的肝臟指數均低于模型組，中劑量組與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損機體具有一定的防護作用。

2.4 對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織指標的影響

乙醇在大量進入機體后，在乙醇脫氫酶的催化下大量脫氫氧化，會抑制肝細胞內脂肪酶活性，引起三羧酸循環障礙，脂肪酸氧化減弱，影響脂肪代謝，導致脂肪在肝細胞內沉積[20]。乙醇在機體中產生過量活性氧會破壞機體的氧化-抗氧化平衡，導致氧化應激，氧化應激使肝細胞內非酶抗氧化物大量消耗，對SOD、GSH-Px等抗氧化酶造成損傷，引起肝細胞膜脂質過氧化反應，損傷肝細胞[21]；因此，肝細胞內TG、SOD、GSH-Px水平可反映酒精性肝損傷程度。

表4 鐵皮楓斗多糖對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織TG、SOD和GSH-Px水平的影響（n=10）Table 4 Effects of Dendrobium candidum polysaccharides on the level of TG, SOD and GSH-Px of liver tissue of alcohol-treated mice (n= 10)

如表4所示，模型組小鼠肝組織的TG含量顯著高于空白對照組（P＜0.05），各劑量組小鼠肝組織的TG含量低于模型組，中、高劑量組與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。模型組小鼠肝組織的SOD和GSH-Px活力極顯著低于空白對照組（P＜0.01），各劑量組小鼠肝組織SOD和GSH-Px活力高于模型組，中劑量組與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.5 對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

如圖1所示，在空白對照組中小鼠肝細胞結構及形態正常、排列整齊、分界清楚、大小均勻，細胞核大而圓，核質分布均勻，核仁清晰。模型組小鼠肝細胞普遍濁腫、排列紊亂，出現以肝細胞變性、壞死或細胞核固縮溶解，大量炎性細胞浸潤。各劑量組及陽性對照組小鼠肝細胞病理損傷明顯減輕，肝細胞排列比較整齊，肝細胞腫脹、變性壞死程度減輕，壞死灶區明顯減少，炎性細胞浸潤程度也明顯較低。

圖1 小鼠肝組織病理學顯微鏡圖（200×）Fig. 1 Pathological changes of liver tissues（200 ×）

3 討 論

過量飲酒已成為世界范圍內發病及死亡的重要原因之一，也是導致急性和慢性肝臟疾病的一個主要原因[22-23]。酒精性肝損傷是酒精誘導的以機體肝臟為主要受損靶器官的應激反應，是復雜的病理生理過程[24]。過量飲酒會引起機體酒精代謝酶活性、抗氧化能力和脂質代謝異常，從而導致肝細胞的功能損傷，造成肝細胞內TG大量聚集[25]，SOD和GSH-Px水平下降，膜結構破壞、通透性改變[26]，使得存在于肝細胞內的轉氨酶（ALT和AST）從細胞逸出，進入血液循環，此時血清ALT、AST水平較正常生理條件升高[27]，ALT、AST水平是臨床醫學上檢查肝功能的重要指標，常用來判斷肝臟是否受到損傷。目前，酒精性肝損傷發病機制尚不完全清晰，尚無公認的有效治療手段，尋找能夠治療酒精性肝損傷的藥物成為研究的一個熱點[28-29]。

多糖作為食源性功能因子，是抗酒精性肝損傷的一類重要物質[30]，具有調節脂質代謝和抗氧化功能，能夠抑制肝損傷的發生[31-32]。鐵皮石斛是一種珍貴的中藥材，多糖是鐵皮石斛的主要活性成分[33]。鐵皮石斛多糖是一種天然乙酰化多糖[34]，具有抗腫瘤、增強免疫力、抗氧化等多種功效。本實驗通過灌胃過量酒精誘導小鼠急性肝損傷，檢測小鼠血清中的TG、AST、ALT水平及肝組織中的TG、SOD、GSH-Px水平，結果表明，模型組與空白對照組間的各檢測指標存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），因此，急性酒精性肝損傷造模成功。相對于模型組，給藥（鐵皮楓斗多糖）后小鼠血清和肝組織中的TG濃度顯著降低（P＜0.05），說明鐵皮楓斗多糖具有改善酒精導致的肝組織脂質代謝異常的作用；同時，中劑量給藥組中小鼠肝組織中的SOD和GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05），因此，鐵皮楓斗多糖可有效維持肝組織的抗氧化體系平衡狀態，減輕酒精引發的肝組織氧化損傷；小鼠血清中的AST、ALT活力也顯著降低（P＜0.05），提示鐵皮楓斗多糖可改善肝細胞膜通透性和流動性，減少肝功能損傷。通過肝組織的病理觀察發現，給藥（鐵皮楓斗多糖）后可明顯減輕小鼠肝細胞病理損傷。因此鐵皮楓斗多糖對酒精致小鼠急性肝損傷有明顯的保護作用，在食品保健和治療藥物方面有較廣闊的開發前景。