肉牛屠宰過程中分離出沙門氏菌的脈沖場凝膠電泳分子溯源分析

董鵬程，張一敏，毛衍偉，梁榮蓉，韓廣星，朱立賢,*，羅 欣,*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 270000 ；2.國家肉牛牦牛產業技術體系臨沂站，山東 臨沂 276000 ）

沙門氏菌是危害公共衛生安全的常見食源性致病菌，據歐盟食品安全局統計，沙門氏菌病在2012—2016年間持續成為歐盟的第二大常見的人畜共患病致病菌，其發生與動物性食品的攝入存在顯著的聯系[1-2]。在我國，沙門氏菌引發的食物中毒案例占細菌食物中毒的70%～80%，并且大多數來源于動物性食品[3]。由于沙門氏菌可以在肉牛等反芻動物腸道中無癥狀地攜帶，因此帶菌動物能夠輕易地通過宰前檢疫環節，成為散播污染的源頭[4]。肉牛屠宰加工涉及多道引發沙門氏菌擴散的高危工序，如宰前禁食引發腸道抑菌能力的下降[5]、宰前糞便污染的擴散、待宰圈內動物交叉污染、機械去皮、去內臟過程中腸道的刺破、胴體清洗噴淋以及胴體與胴體、胴體與設備及操作人員的接觸[6-7]。如果處置不當，這些工序極易造成沙門氏菌從源頭向內部的擴散，威脅最終的產品安全[8]。我國和歐盟均對肉制品沙門氏菌實行零容忍制度，歐盟規定去皮后、冷卻前牛胴體沙門氏菌陽性檢出率不得高于4%[9]。因此，對肉牛屠宰過程中不同工序中分離出的沙門氏菌進行溯源分析，確定交叉污染的高危環節，并對關鍵環節設置干預措施，對于控制工廠內部沙門氏菌的污染、保證肉品安全具有重要意義[10]。

由于沙門氏菌在屠宰企業內部交叉污染高度的同源性及較低的流行率，傳統的流行病學調查、血清及噬菌體分型提供的信息不足以對工廠內部交叉污染進行有效溯源[11-13]；同時，由于指示菌和致病菌之間聯系的不確定性，以大腸菌群作為指示菌來評估工廠內部沙門氏菌的流行及減菌效果仍存在爭議[9,14-15]。因此，在傳統流行病學調查的基礎上，應用分子溯源技術對沙門氏菌進行污染路徑的溯源，尋找致病菌交叉污染關鍵環節，是輔助肉牛屠宰企業進行致病菌防控的重要手段。近年來，與分子生物學相結合的基因分型技術已經在流行病學研究中被廣泛應用，其具有更強的分辨能力，是對傳統方法的補充。相比于其他分子分型技術，脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）作為分子分型的“金標準”[16]，具有較好的重現性、與其他方法幾乎一致的區分性及更為清晰且易分析的條帶分布[13]，加之全球范圍內完善的分型數據庫及標準化操作程序，使之成為屠宰企業致病菌溯源、獲取基礎流行數據的有效手段。由于我國肉牛較高的沙門氏菌帶菌率及相對落后的宰前管理[17]，工廠內部干預措施和控制節點是遏制其進入下游分銷領域的重要防線。本研究對屠宰線上6 個工序分離出的沙門氏菌使用PFGE法進行溯源分析，試圖找到沙門氏菌在屠宰過程中交叉污染的關鍵工序，為肉牛屠宰企業設置關鍵減菌環節及規程提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 屠宰工藝及取樣點

圖1 肉牛屠宰工藝流程及采樣點設置Fig. 1 Flow chart for beef cattle slaughtering and setting of sampling points

屠宰工藝如圖1所示，動物宰前禁食24 h、禁水12 h，在進入屠宰間前使用溫水沖淋，然后在牛雙耳與雙眼十字交叉點用高壓氣槍將其擊暈，上軌吊掛后切斷氣管、食管、血管進行宰殺，放血結束后進行取樣點A（皮毛）的樣品采集，具體采樣方法參見Dong Pengcheng等的實驗步驟[17]。采樣結束后使用液壓剝皮機進行去皮操作，將牛尾從第一與第二尾椎間斷開，隨皮向外翻出，使被毛不與胴體表面接觸，逐步下翻直至皮毛脫離，對去皮后胴體進行取樣點B（去皮后）的樣品采集。去除白臟后，在內臟處理車間找到對應號碼的牛的直腸，完成取樣點G（糞便）的樣品采集。去臟后的胴體經過清水噴淋后進入預冷間，在進入預冷間前設置取樣點D（噴淋后）。預冷結束后進行排酸，排酸24 h后進入排酸庫，完成取樣點E（排酸后）的樣品采集。隨后進行剔骨和分割，在分割生產線上完成取樣點F（分割肉）的樣品采集。

1.2 材料與試劑

用于PFGE分型的48 株沙門氏菌分離于山東3 個肉牛屠宰場（分別記為工廠X、Y、Z）的6 個不同屠宰工序中，所有菌株均通過聚合酶鏈式反應與生化鑒定，并進行了血清分型與耐藥性實驗[17]。分型菌株的血清型及在不同屠宰工序、不同肉牛屠宰企業的分布如表1所示。

表1 PFGE分型的48 株沙門氏菌的血清型、來源工廠及來源工序Table 1 Serotypes, source plants and source procedures of 48 Salmonella strains isolated for PFGE typing

沙門氏菌標準菌株H9812 深圳市疾病預防控制中心；一次性血瓊脂平板 北京陸橋技術股份有限公司；XbaI限制性內切酶、蛋白酶K 寶生物工程（大連）有限公司；Tris-base、TBE緩沖液、N-十二烷酰基肌氨酸、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸 美國Sigma公司；Seakem Gold PFGE級瓊脂糖 美國Bio-Rad公司。

1.3 儀器與設備

Chef Mapper脈沖場電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；恒溫水浴搖床 德國Memmert公司；Milli-Q純水儀 美國Millipore公司；Vitek Colorimeter濁度計 法國BioMérieux公司。

1.4 方法

參照PulseNet沙門氏菌PFGE標準分型方法[18]進行操作。

1.5 數據處理與分析

通過Gel DOC XR+成像儀配套Image Lab軟件獲得“.scn”格式文件，將文件導出TIF格式后，使用BioNumerics軟件進行識別，使用H9812菌株作為分子質量標準進行條帶位置的確定及必要的手工校正，使用非加權配對算數平均法構建聚類圖，采用Dice系數來衡量PFGE帶型之間的相似度。

2 結果與分析

部分PFGE結果如圖2所示，48 株不同血清型沙門氏菌經過包埋、消化、酶切，最終電泳后均得到清晰的PFGE圖譜，所有菌株均被有效酶切，并產生11～18 條20～1 100 kb的條帶。在所有菌株中共找到22 種（記為PT1～PT22）不同的PFGE型（圖3）。標準菌株H9812酶切后所得到的電泳條帶清晰、完整，所得圖譜適合于進一步的聚類分析。

圖2 部分沙門氏菌使用Xba I酶切后獲得的PFGE圖譜Fig. 2 PFGE profile of genomic DNA of Salmonella strains using Xba I digestion

圖3 48 株沙門氏菌的聚類圖譜Fig. 3 Cluster analysis dendrogram of 48 Salmonella strains

譜圖經過帶型校正和標記，使用BioNumerics軟件進行聚類分析，采用Dice系數得到親緣關系樹狀圖譜。如圖3所示，所有菌株最高相似度為100.0%，最低相似度為48.0%，在77.5%的相似度上將48 菌株分為I～V 5 個大簇，每一簇與分離工廠具有較強的相關性。來源于X工廠的29 株沙門氏菌分布于II、V兩大簇，來源Y工廠3 株沙門氏菌位于第IV簇，來源于Z工廠的16 株沙門氏菌分布于I、III 2 個大簇。同一大簇內菌株全部為單一工廠分離，不同工廠（地域）之間未發現高度相似的PFGE型。該結果可能與樣品來源有一定的關系，本次分型的株菌來源于3 個距離較遠的屠宰企業（直線距離最近為300 km，最遠為500 km），屠宰動物主要以周邊農戶飼養為主，沒有跨地區調運的牛源，這些因素造成了一定的地理隔離，Zhou Zihao等[3]對生豬屠宰線的溯源結果也證實了同一工廠內部分離出的沙門氏菌具有高度的同源性。當食品樣品來源復雜、經歷的儲運環節變多時，交叉污染更容易產生。Ni Pei’en等[19]對上海零售農產品檢測出的沙門氏菌進行溯源，發現牛肉與雞肉分離出的沙門氏菌具有高度一致的基因型，且在不同時間、不同地域、不同種類農產品中均分離出相似基因型的沙門氏菌，個別基因型追溯到了屠宰企業。

在93.0%的相似度下，所有菌株被分為14 個不同的亞簇（A～N），同一亞簇內菌株圖譜使用肉眼較難區分。隨著相似度的提升，同一大簇具有根據血清型進一步分化為不同亞簇的趨勢，如第I大簇分化為A～C 3 個亞簇，每個亞簇包含1（如B、C亞簇）或2 種（如A亞簇）血清型。提高相似度至95.7%，含有多種血清型的亞簇進一步被分解為包含單一血清型的不同基因型（例如A亞簇分解為PT1～PT3 3 種基因型），與此同時，同種血清型的不同菌株也得到進一步分化。該結果與Torpdahl等[13]的研究一致，該學者將來源于丹麥病人和動物的110 株沙門氏菌進行PFGE分型，發現PFGE技術能夠將不同血清型的沙門氏菌進行有效區分，同時能在一定程度上將同種血清型的不同菌株進行進一步細分，提示PFGE型比血清型具有更強的分辨能力。

以95.7%的相似度對來源于胴體的5 株沙門氏菌進行溯源分析，有3 株沙門氏菌（基因型PT8、PT11、PT13）追溯到了源頭。在基因型PT8中，分離于噴淋后10號牛胴體的134-X-D10-AGO菌與137-X-A10-AGO、053-X-A09-AGO、067-X-A14-AGO、071-X-G09-AGO、136-X-G06-AGO菌有著相同的血清型和96.3%的相似性，而后5 株菌分別來自相同或不同動物的皮毛，由此推斷噴淋后胴體的沙門氏菌（134-X-D10-AGO）很有可能來源于自身的皮毛（137-X-A10-AGO），而由于宰前動物之間的接觸，來源于10號牛皮毛的沙門氏菌很有可能來自9號牛（053-X-A09-AGO）、14號牛（067-X-A14-AGO）的交叉污染。進一步向上進行溯源，9號牛的糞便（071-X-G09-AGO）極有可能是污染的最初來源。該溯源結果證實了屠宰加工企業內部存在糞便-皮毛-胴體的交叉污染途徑。國外眾多學者對沙門氏菌在屠宰過程中的分離情況進行了調研，通過大量數據的歸納得出了皮毛、糞便是胴體最為重要的污染來源的推論[17,20]，本次溯源結果從基因水平上提供了上述推論的直接證據。類似的交叉污染路徑在基因型PT11（X工廠）、PT13（Z工廠）中也得到了驗證。

除胴體污染外，分型結果顯示宰前動物存在更為普遍和嚴重的糞便-皮毛、皮毛-皮毛的交叉污染模式。在基因型PT18中，來源于2、3、12、13號牛糞便的山夫登堡沙門氏菌和來源于11、12號牛皮毛的沙門氏菌具有96.0%的相似性；在基因型PT22中，來源于13號牛糞便的卡拉巴爾沙門氏菌和來源于2號牛皮毛的沙門氏菌具有相同的基因型，同樣的結果在Z工廠也得到了證實（基因型PT1、PT5）。這些結果說明宰前動物存在嚴重的皮毛-糞便交叉污染。在基因型PT4中，分離于Z工廠的1、4、7號3 頭牛皮毛的4 株阿貢納沙門氏菌具有96.0%～100.0%的相似性；在基因型PT15中，同樣是分離于1、7號兩頭牛皮毛的2 株德爾卑沙門氏菌具有96.3%的相似性，說明沙門氏菌在宰前動物中存在皮毛-皮毛的交叉污染模式。

相對于血清分型，本研究證實PFGE能夠提供更高的分辨率，進而提供更為準確的追溯結果：雖然來自X工廠14號牛皮毛的兩株沙門氏菌065-X-A14-AGO與069-X-A14-AGO來源及血清型均相同，但是其P F G E相似度僅為87.0%，且通過目視分析其圖譜差異較大，說明14號牛皮毛存在多種基因型沙門氏菌的交叉污染。同樣，基因型PT4和基因型PT13的相似度僅為50.9%，因此同工廠、同動物、同血清的來源于基因型PT4的012-Z-A07-AGO與來源于基因型PT13的017-Z-A07-AGO具有較大差異。該分型結果證實了Z工廠7號牛皮毛中存在多種PFGE基因型沙門氏菌，而引發該廠胴體污染的沙門氏菌620-Z-B08-AGO與基因型PT13的017-Z-A07-AGO具有較高相似性，而非與基因型PT4的其他4 株菌相似，進而排除了其來自于1號與4號牛皮毛的可能。雖然PEGE比噬菌體分型、多位點序列分型、多位點可變數目串聯重復序列分析有更強的分辨效果，并在零售食品中的溯源得到了廣泛的應用[19,21-22]，然而鮮見采用PEGE法在屠宰廠內部對不同工序分離出的沙門氏菌進行溯源。Loiko等[8]對分離于108 個胴體的大腸桿菌O157：H7和單增李斯特菌進行PFGE溯源，發現其在宰前動物之間、屠宰工序之間具有交叉污染的現象，與本研究的結果相似。Gomes-Neves等[23]對葡萄牙生豬屠宰廠使用PFGE法進行了沙門氏菌的溯源分析與關鍵點控制，發現同種基因型存在于不同的取樣點，證實了企業內部存在交叉污染，與本研究結果一致。同時，借助PFGE溯源分析，Gomes-Neves等推斷出衛生干預系統的失效、工人操作不規范、淋巴組織的刺破是交叉污染的重要誘因。鑒于屠宰企業內部沙門菌的低檢出率及生物指示菌的使用仍存爭議，對不同工序分離出的沙門氏菌進行溯源分析，對于確定屠宰企業內部沙門氏菌傳播特點、干預措施的制定以及沙門氏菌傳播的阻斷具有重要意義。

3 討 論

2013年新發布的GB 29921—2013《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》中明確規定：在熟肉及即食生肉制品中，按照二級采樣方案，在被檢的5 份樣品中，不允許任一樣品檢出沙門氏菌。Ni Pei’en等[19]對上海零售豬肉進行了檢測與溯源，發現檢出菌株與屠宰企業分離出的菌株高度同源，并且該菌株能夠通過交叉污染感染其他種類農產品。因此，應從源頭控制沙門氏菌向下游產品的傳播，保證食品安全。因為我國較高的宰前動物帶菌率[17]和沙門氏菌可在肉牛腸道中無癥狀攜帶的特點，屠宰加工過程成為隔斷沙門氏菌傳播的關鍵環節。肉牛屠宰企業急需確定沙門氏菌在屠宰加工中傳播的關鍵環節，并針對高危環節制定有效地干預措施，控制沙門氏菌向胴體、成品的蔓延，從源頭封堵食品安全威脅。雖然很多學者在零售、分銷水平對沙門氏菌進行了溯源追蹤[24-27]，并推測屠宰企業是可能的源頭[19]，然而關于工廠內部沙門氏菌的來源及分布特點的研究仍然匱乏。本研究對分離于肉牛屠宰過程中6 個不同取樣點（糞便、皮毛、去皮后、噴淋后、排酸后、分割肉）的48 株不同血清型沙門氏菌進行PFGE分子溯源分析，試圖找到沙門氏菌在屠宰過程中傳播的路徑與關鍵工序，探究PFGE法在屠宰企業內部進行沙門氏菌溯源的可行性，為屠宰企業防控沙門氏菌向下游產品的蔓延提供理論依據。

通過PFGE對來源于胴體的5 株沙門氏菌進行溯源分析，有3 株沙門氏菌追溯到了源頭。本研究使用分子手段直接證實了工廠內部存在糞便-皮毛-胴體的交叉污染路徑，該路徑的發現說明沙門氏菌已經穿過屠宰企業防控屏障，來源于糞便的沙門氏菌最終對胴體（潔凈區）造成了污染，Aslam等[28]對屠宰企業中腸桿菌的溯源追蹤也發現了類似的傳播途徑。如不采取有效措施對這一傳播路徑進行阻斷，生鮮肉及其制品將面臨巨大的安全風險，甚至有可能在肉品分銷運輸中對其他食品造成更大范圍的交叉污染。與此同時，有1 株分離于噴淋后胴體、分割肉的沙門氏菌未能追溯到源頭，不能排除企業內部存在其他污染源頭的可能，如淋巴結[29]、屠宰環境[26]、噴淋用水[30]、屠宰工具及操作工人等，應進一步對這些潛在源頭進行確認。

對分離于不同動物糞便和皮毛的沙門氏菌進行溯源，結果表明沙門氏菌在不同動物的皮毛、同種動物的皮毛和糞便、不同動物的皮毛和糞便中存在更為嚴重的交叉污染。說明屠宰企業在改善宰前管理、控制交叉污染方面具有較大的改進空間。動物在宰前運輸、待宰、驅趕的過程中存在一定量的糞便排泄，糞便中攜帶的沙門氏菌很有可能通過動物臥地休息與動物接觸，進而擴散到皮毛，進一步擴散到整個牛群。因此，應嚴格控制動物禁食時間、待宰圈密度、待宰圈及運輸工具的消毒程序，合理的禁食、宰前淋浴、飼料結構的調整、低水平的應激不僅能夠有效調節宰前動物腸道生態，抑制沙門氏菌的傳播，降低待宰動物載菌量，減小工廠內部其他干預措施的壓力，控制胴體污染率，同時對于保證牛肉品質、預防黑干肉（dark, firm, dry，DFD）的發生具有重要作用[5,31-32]。目前多數屠宰企業DFD牛肉的發生率在20%左右，部分企業甚至達到40%，其宰前管理缺失可見一斑。

本研究通過對沙門氏菌污染路徑的分析，確認皮毛是交叉污染的重要媒介，同一頭動物在皮毛上攜帶多種不同基因型、不同血清型的沙門氏菌的現象也較為普遍（如基因型PT4與PT15、PT1與PT4、PT11與PT18等）。動物的皮毛對微生物在牛群、屠宰企業內部的散播方面具有重要作用。一方面，作為接觸媒介，很容易通過動物的臥地休息、相互接觸將糞便中的沙門氏菌擴散到自身乃至牛群中[20,33]；另一方面，由于屠宰過程中去皮過程涉及機械力的撕扯，皮毛中的致病微生物極易在撕扯過程中擴散到無菌的胴體上，成為下游污染的源頭[8]。鑒于皮毛被沙門氏菌污染的高風險以及對胴體污染的巨大威脅[8,34]，應對去皮后的胴體設置噴淋減菌干預點，然而該關鍵點在國內企業鮮受重視。

4 結 論

應用PFGE技術對屠宰線上不同取樣點分離出的沙門氏菌進行溯源分析，結果表明，存在于動物胃腸道的沙門氏菌已穿過屠宰企業防控屏障，對最終對胴體造成了污染。宰前不同動物皮毛和糞便間存在嚴重的交叉污染現象，皮毛是交叉污染的重要媒介，為工廠內部衛生環境的保持帶來巨大壓力。在重視動物宰前管理的同時，應改進屠宰線設計，設置去皮后胴體的噴淋減菌干預措施，并在“臟區”與“潔凈區”之間設置嚴格的物理隔離措施，以遏制沙門氏菌向下游胴體的傳播。PFGE分型數據不僅與前期血清分型、流行病學調查結果吻合，同時提供了更高的分辨效果，在屠宰企業內致病菌檢出率低、同源性高的情況下提供了有效的溯源追蹤手段。