佛手皮渣果膠改性及其對鎘誘導肝腎損傷的預防作用

吳莎極，寇興然，丁寅翼，王洪新*

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122 ）

鎘（cadmium，Cd）是一種對人體健康非常有害的重金屬，具有很高的“土壤-植物遷移轉化率”，能夠從土壤向稻米、花生、向日葵、煙草等多種作物中遷移，并大量蓄積，從而進入食物鏈，影響食品安全，進一步影響人體健康[1]。近十年來，針對北京、上海、江蘇、浙江、福建、廣州等地的食品抽查結果顯示，含鎘食品檢出率超過50%，超標率達到7.3%。鎘污染的主要食品包括大米、蔬菜、食用菌、動物內臟、水產品等[2]。鎘進入人體的主要渠道是消化道和呼吸道，對于非職業接觸鎘及無吸煙習慣的普通人群來說，鎘的暴露途徑主要為膳食渠道[3]，即鎘通過食物攝入被消化道吸收，進入血液，繼而在各個組織器官中長時間積蓄[2]，其中，主要的靶點器官為肝臟和腎臟[4]。鎘引起急性中毒癥狀包括咳嗽、胸悶、呼吸困難、惡心、腹痛，以及急性肝臟損傷導致死亡[5-6]。慢性中毒癥狀包括腎臟和肝臟的損傷、生殖器官損傷、心血管疾病以及癌癥等[7-8]。由于靜脈注射螯合劑藥物防止鎘中毒的方法存在毒副作用和有效性較低等缺陷[9-10]，目前，相關研究主要采用營養干預或膳食療法，包括補充微量元素[11]、植物提取物[12-13]等。

佛手是一種廣泛種植于東方國家的植物，屬于蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）。長期以來，佛手一直被作為一種中醫藥物用于治療高血壓、呼吸道感染等慢性疾病。現在食品工業關注對佛手相關食品的研發，將佛手作為功能性食品原料加以利用，例如佛手果脯、佛手發酵酒、佛手飲料、佛手保健茶、佛手酥等[14]。但是，傳統的佛手食品加工工藝首先會去除佛手果皮，因此會產生大量未被利用的皮渣，丟棄后造成嚴重的環境問題。研究發現，佛手皮渣中含有多種具有生理活性的功能性物質，例如精油、黃酮、果膠等。其中，果膠的質量占干質量的15%～25%[15]。因此，提取佛手皮渣中的果膠物質，既能緩解佛手皮渣對環境造成的影響，還能大大提高佛手的綜合利用價值。

果膠是一類植物性多糖物質，由超過100 個（α-1,4）相連的α-D-半乳糖醛酸殘基組成[16]。目前，果膠被主要用作生物清除劑。Khotimchenko等[17]研究發現，果膠具有很強的重金屬離子吸附力，能夠清除人體血液中的重金屬離子。果膠能夠有效吸附土壤和水環境中的重金屬污染，例如鉛、銅、汞等[18]。然而，將果膠作為食品添加劑，用于緩解食品中鎘超標對人體損害的研究還非常少。因此，進一步研究佛手皮渣中果膠的提取具有很高的應用價值和發展前景。目前，提取果膠的方法包括微生物提取法、酸提法、酶提法、微波提取法等[19-20]。與這些傳統方法相比，超聲輔助提取法具有高頻特性，且有加熱速度快、加熱均勻、易控制、節能環保等優點[21]。本實驗在酸提的基礎上，使用超聲輔助的方法獲得佛手皮渣果膠。然后通過調節pH值方法對獲得的佛手進行改性，獲得低酯化度果膠，并對其鎘的吸附能力及吸附性質進行分析。然后，通過動物模型探究佛手皮渣果膠對鎘引起的肝腎損傷的預防作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

成年雄性ICR小鼠及SD大鼠，體質量（30±2）g，購于上海斯萊克動物實驗有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2007-0005。

佛手原料由浙江省金華市金手寶有限公司提供。

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GPx）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）試劑盒、谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）試劑盒、總膽紅素試劑盒、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）試劑盒、尿素氮試劑盒、肌酐試劑盒、尿蛋白試劑盒南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度試劑盒 碧云天生物技術公司。本實驗所用試劑均為優級純。

1.2 儀器與設備

UV-2100紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；SHZ-III循環水式真空泵 上海姜強儀器有限公司；FW80高速粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；原子吸收分光光度計 美國瓦里安公司；Epoch微孔板分光光度計 美國BioTek公司；臺式高速冷凍離心機5804R 德國Eppendorf公司；超低溫冷凍冰箱、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）儀 美國Thermo Fisher公司；電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma source mass spectrometer，ICP-MS）儀 美國PerkinElmer公司；Ussing Chamber體外吸收模擬系統 上海贊德儀器有限公司；石蠟切片機 德國Leica公司；小鼠代謝籠江蘇賽昂司生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 佛手皮渣的預處理與提取

將佛手皮刮下，佛手皮渣質量約占佛手總質量的8.22%。參考畢雙同[22]的方法對佛手原料進行預處理及滅酶：將佛手皮渣用無水乙醇回流（100 ℃，15 min）滅酶，再用體積分數70%乙醇溶液回流（85 ℃，1 h），重復3 次，去除小分子糖，過濾，用體積分數70%乙醇溶液洗滌沉淀，直至上清液中不再發生糖的Molish反應為止，將樣品在55 ℃下鼓風干燥，粉碎，用60 目篩子過篩，干燥備用，測定水分含量。

參照鄧剛等[23]的方法，使用超聲輔助酸提法從預處理后的佛手皮渣粉中提取果膠，提取條件如下：使用鹽酸作為提取酸，料液比為1∶60，提取溫度為70 ℃，超聲功率為350 W，pH 1.5。將上述條件下獲得的果膠提取液通過真空旋轉蒸發濃縮，然后加入體積分數95%乙醇溶液，于4 ℃冰箱中靜置12 h，將沉淀包裹在濾布中，擠掉乙醇，并用無水乙醇洗滌沉淀。最后將沉淀置于真空冷凍干燥機中干燥后稱量。最后果膠的得率為22.7%。

1.3.2 果膠含量的測定

參照NY/T 2016—2011《水果及其制品中果膠含量的測定 分光光度法》測定果膠含量。用咔唑比色法制作半乳糖醛酸標準曲線，以半乳糖醛酸的含量計果膠含量。果膠含量按式（1）計算。

式中：ω為實驗樣品中的果膠質量分數（以半乳糖醛酸計）/%；ρ為根據標準曲線得到的半乳糖醛酸質量濃度/（μg/mL）；V為果膠浸提液的總體積/mL；N為浸提液的稀釋倍數；m為樣品的質量/g。

1.3.3 果膠改性

根據Wai等[24]的方法，通過改變pH值和溫度對本研究提取的佛手皮渣果膠（finger citron peel residue pectin，FCP）進行改性。改性目的是降低果膠酯化度，增加游離羧基數量，從而提高果膠的重金屬吸附能力。主要步驟如下：將果膠用蒸餾水配制成質量分數1.5%的溶液。然后使用NaOH將溶液的pH值調整至10.0，在60 ℃下孵育1 h。溶液冷卻至室溫后，用HCl調節pH值至3.0，90 ℃振蕩10 h。然后加入體積分數95%乙醇溶液，并在4 ℃下放置過夜。過濾獲得沉淀，用體積分數95%乙醇溶液洗滌沉淀。將獲得的果膠置于真空冷凍干燥機中干燥，并研磨。所獲得的果膠即為改性佛手皮渣果膠（modified fi nger citron peel residue pectin，mFCP）。

1.3.4 果膠酯化度檢測

根據Wai等[24]的方法使用FT-IR對果膠中的游離羧基進行分析。果膠酯化度測定方法參照GB 25533—2010《食品安全國家標準 食品添加劑 果膠》，采用高甲氧基果膠的堿液滴定法。果膠酯化度按式（2）計算。

式中：Y為果膠酯化度/%；V1為初始滴定時消耗的0.1 mol/L NaOH標準滴定溶液的體積/mL（初始滴定度）；V2為皂化滴定時消耗的0.1 mol/L NaOH標準滴定溶液的體積/mL（皂化滴定度）。

1.3.5 果膠吸附鎘的吸附熱力學和動力學特性

參考Kartel[25]和Senthikumaar[26]等的方法研究果膠吸附鎘的熱力學和動力學特性。

1.3.5.1 吸附熱力學解析

將mFCP以1∶100（m/V）比例溶于0.06～90 mg/L CdCl2溶液中，37 ℃勻速攪拌至吸附平衡，抽濾獲得濾液，用原子吸收光譜法測定濾液和原液中鎘的含量，并按式（3）計算果膠吸附量。

式中：ω為果膠吸附量/（mg/g）；ρi為吸附初始鎘質量濃度/（mg/L）；ρe為吸附平衡時鎘質量濃度/（mg/L）；V為反應液體積/L；m為體系中果膠質量/g。

1.3.5.2 吸附動力學解析

將佛手皮渣果膠以1∶100（m/V）比例溶于10 mg/L CdCl2溶液中，37 ℃勻速攪拌，分別在2.5、5、7.5、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210、240、270、300 min時取樣測定吸附后溶液，抽濾獲得濾液，用原子吸收光譜法測定濾液和原液中鎘的含量，并計算吸附量。果膠吸附量按式（4）計算。

式中：ω為果膠吸附量/（mg/g）；ρ0為吸附初始鎘質量濃度/（mg/L）；ρ1為吸附后鎘質量濃度/（mg/L）；V為反應液體積/L；m為體系中果膠質量/g。

1.3.6 動物實驗設計

60 只成年雄性ICR小鼠飼養于江南大學實驗動物中心，飼養環境中無致病菌，光暗周期為12 h，室溫控制（24±2）℃，相對濕度55%～65%。小鼠飼料為標準顆粒飼料，自由飲用純凈水。動物實驗流程經江南大學實驗動物倫理委員會許可，所有操作均參考歐盟關于動物實驗的指導條例。

1.3.6.1 實驗分組

ICR小鼠預飼一周后，隨機分為6 組（n＝10），每組平均體質量保持一致：1）正常對照組（CON組）：每天灌胃生理鹽水；2）鎘暴露組（Cd組）：每天灌胃CdCl2溶液，灌胃量為0.25 mg/kg mb；3）低劑量FCP干預組（Cd+FCP1組）：每天灌胃FCP，灌胃量為0.5 mg/kg mb，30 min后灌胃CdCl2溶液，灌胃量為0.25 mg/kg mb；4）高劑量FCP干預組（Cd+FCP2組）：每天灌胃FCP，灌胃量為1 mg/kg mb，30 min后灌胃CdCl2溶液，灌胃量為0.25 mg/kg mb；5）低劑量mFCP干預組（Cd+mFCP1組）：每天灌胃mFCP，灌胃量為0.5 mg/kg mb，30 min后灌胃CdCl2溶液，灌胃量為0.25 mg/kg mb；6）高劑量mFCP干預組（Cd+mFCP2組）：每天灌胃mFCP，灌胃量為1 mg/kg mb，30 min后灌胃CdCl2溶液，灌胃量為0.25 mg/kg mb。

灌胃20 d后，將小鼠置于代謝籠內24 h，收集小鼠尿液和糞便用于鎘含量分析。最后，用乙醚麻醉小鼠，摘眼球取血，斷頸處死小鼠。肝臟、腎臟用于臟器指數分析、形態學分析、組織鎘含量分析、抗氧化指標測定。臟器指數按式（5）計算。

1.3.6.2 血漿、肝臟、腎臟抗氧化能力指標測定

小鼠眼球取血，血液收集于肝素鈉抗凝管，將全血3 500 r/min、4 ℃離心獲得血漿。取一定量的肝臟和腎臟，用生理鹽水制成質量分數10%的勻漿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液。按照試劑盒說明書測定小鼠血漿T-AOC，肝臟和腎臟SOD、CAT、GPx活力，以及NO和MDA的水平。

1.3.6.3 肝腎功能指標的測定。

取小鼠血漿，按照試劑盒說明書測定血漿中AST、ALT、總膽紅素、γ-GT、尿素氮、肌酐水平，以及尿液中蛋白質量濃度。

1.3.6.4 肝臟腎臟形態學分析

小鼠肝臟和腎臟用體積分數10%多聚甲醛磷酸緩沖液固定，經乙醇梯度脫水，用石蠟包埋機進行石蠟包埋。在石蠟切片機上制成厚度為5 μm的連續切片。根據HE染液試劑盒說明書方法進行HE染色。光學顯微鏡下觀察組織形態并拍照。

1.3.7 小鼠血液、尿液、糞便、組織中鎘含量的測定

將一定量的糞便、肝臟、腎臟、尿液、血液樣品轉移至消化罐內，并記錄樣品的質量或體積。加入適量硝酸，在微波消解系統中進行消化。然后使用ICP-MS系統檢測鎘的含量。

1.3.8 FCP和mFCP的Ussing-Chamber體外模擬吸收實驗設計

配制好新鮮的Krebs-Ringer緩沖液（含有118 mmol/L NaCl、4.75 mmol/L KCl、1.18 mmol/L KH2PO4、1.18 mmol/L MgSO4、2.5 mmol/L CaCl2、25 mmol/L NaHCO3和11 mmol/L葡萄糖）[27]，通入混合氣體（95% O2和5% CO2）15 min。分離SD大鼠空腸置于Krebs-Ringer緩沖液中冰浴培養5 min。剪取4 cm左右的空腸，迅速分離筋膜層，將腸黏膜固定在Ussing-Chamber的擴散池上。將0.5 g/100 mL和1 g/100 mL兩種不同質量濃度的FCP和mFCP溶液（用Krebs-Ringer緩沖液配制）與Krebs-Ringer緩沖液預熱至37 ℃，通入混合氣體（95% O2和5% CO2），整個系統保持在37 ℃恒溫。向黏膜側分別加入5 mL生理鹽水和配制好的FCP、mFCP溶液，漿膜側加入相同體積的Krebs-Ringer緩沖液。分別于0、30、60、90、120 min在漿膜側取樣100 μL。并補充100 μL預熱的Krebs-Ringer緩沖液。檢測漿膜側溶液中果膠的含量，檢測方法同1.3.2節。

1.4 數據統計分析

所有測定數據均采用平均值±標準差表示。采用SPSS 20.0統計軟件對數據進行分析，組間比較采用t檢驗，雙側檢驗，P＜0.05時表示存在顯著差異，P＜0.01時表示存在極顯著差異。用Origin Pro 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 FCP和mFCP酯化度比較

本實驗未改性的FCP的酯化度為78.3%～81.5%，屬于高酯化度果膠，而mFCP酯化度為35.4%～45.6%，屬于低酯化度果膠[28]。

圖1 mFCP和FCP的FT-IR光譜結果Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of mFCP and FCP

1 760～1 730 cm-1和1 630～1 600 cm-1條帶分別表示酯羰基和羧基的振動條帶。由圖1可知，FCP的酯羰基條帶的強度明顯高于羧基條帶的強度。相反，mFCP的羧基條帶強度明顯高于酯羰基條帶的強度。結合酯化度結果，本研究通過酸堿改性手段，降低了佛手皮渣果膠的酯化度，讓更多的游離羧基暴露出來，而游離羧基則被認為是果膠吸附重金屬的主要位點[23]。

2.2 mFCP對鎘離子的吸附熱力學分析

圖2 mFCP對鎘的平衡吸附等溫線Fig. 2 Adsorption isotherm of cadmium binding by mFCP

為分析mFCP吸附鎘的熱力學性質，選取不同初始質量濃度下的CdCl2溶液進行吸附實驗，獲得平衡吸附量和平衡溶液質量濃度之間的平衡吸附等溫線。由圖2可見，在較低的初始質量濃度下，果膠表面具有較多的鎘離子結合位點，吸附效率比較高，吸附能力隨著初始鎘質量濃度的增加而增加，直到平衡。通過不同的模型對獲得的吸附等溫線進行擬合，各模型參數值見表1。由3 個模型相關系數R2可知，Langmuir-Freundilich雙模型具有最佳的擬合優度（R2＝0.994 2），可以更好地描述果膠對鎘離子的吸附過程。另外，Langmuir模型和Freundlich模型的相關系數分別為0.983 8和0.973 6，也有較高的吻合度。

表1 各等溫線模型及相關吸附常數Table 1 Adsorption constants derived from simulations with different isotherm models

Langmuir模型是假設吸附劑表面均勻，各處吸附能相同，且吸附過程為單分子層吸附的模型。當吸附劑表面被吸附對象占位飽和時，吸附量達到最大值，該過程對應物理吸附過程[29]。該模型方程各參數中，Qmax表示吸附劑的最大吸附容量，本實驗果膠對鎘的理論最大吸附量為981.54 mg/g，實際最大吸附量為985.36 mg/g，比較相近。bL表示吸附系數，是吸附速率常數和脫吸附速率常數的比值，表示吸附對象和吸附劑之間的親和強度[30]。本研究中吸附熱力學曲線與Langmuir吸附模型有一定吻合度，說明mFCP對鎘的吸附過程涉及表面物理性吸附。Freundlich模型是假設吸附劑表面不均勻，吸附熱隨著覆蓋度的增加而呈現指數下降，適用于化學吸附和物理吸附等多種情況[31]。該模型方程中，KF表示吸附劑的吸附能力，nF是Freundlich平衡參數，代表吸附強度。當0.1＜1/nF＜0.5時，吸附強度較大；當0.5＜1/nF＜1時，吸附強度較差；而當1/nF≥1時，吸附強度最弱[32]。本研究獲得的mFCP對鎘離子的吸附滿足0.1＜1/nF＜0.5（1/nF＝0.434 9），說明具有很高的吸附強度。Langmuir-Freundlich雙模型中，n是一個不均勻性參數。n值越偏離1，則說明吸附劑表面越不均勻[33]。本研究中，n為1.775 5，表示吸附劑（果膠）表面的吸附能量是不均勻的，吸附中心呈現多樣性。另外，本實驗吸附過程與Langmuir-Freundlich雙模型吻合度最高，說明吸附過程主要涉及離子交換過程[34]。

2.3 FCP和mFCP對鎘離子的吸附動力學比較

圖3 mFCP和FCP在不同時間點對鎘的吸附Fig. 3 Cadmium binding of mFCP and FCP at different time points

如圖3所示，在相同質量濃度條件下，mFCP對鎘的吸附平衡質量濃度明顯高于FCP。本實驗通過對佛手皮渣果膠進行改性，降低其酯化度，從而大大提高了對鎘的吸附能力。

2.4 FCP和mFCP體外模擬吸收特性

表2 FCP和mFCP的Ussing-Chamber漿膜側溶液中的果膠含量（以半乳糖醛酸含量計）Table 2 Concentration of pectin at the serosa side of FCP and mFCP(calculated as concentration of galacturonic acid)

吸收實驗開始后的0、30、60、90、120 min分別在漿膜側取樣測果膠含量。如表2所示，在黏膜側加入不同質量濃度的FCP和mFCP溶液后，漿膜側始終未檢測到半乳糖醛酸，說明這兩種果膠均不能被腸道吸收進入體循環。結合FCP和mFCP對鎘離子的結合能力結果，本實驗說明FCP和mFCP對鎘離子的吸附主要在腸道內進行，而不是在血液中進行。該結果進一步證實，FCP和mFCP在胃腸道內對鎘離子進行結合后，能夠有效防止鎘離子被腸道吸收而進入體循環。

2.5 鎘暴露和mFCP、FCP預防對小鼠肝腎指數的影響

圖4 鎘暴露及FCP、mFCP預防對小鼠肝腎指數的影響Fig. 4 Effects of cadmium exposure and FCP versus mFCP on visceral indices of liver and kidney

如圖4所示，鎘暴露導致小鼠肝臟指數極顯著高于對照組小鼠（P＜0.01），說明肝臟出現腫脹。進行mFCP和FCP預防處理后，肝臟腫脹現象顯著好轉，肝臟指數極顯著低于鎘暴露組小鼠（P＜0.01）。另外，鎘暴露小鼠腎臟指數極顯著低于對照組小鼠（P＜0.01），說明腎臟出現萎縮。進行mFCP和FCP預防處理后，腎臟萎縮現象顯著好轉，腎臟指數顯著高于鎘暴露組小鼠（P＜0.05，P＜0.01）。同劑量下FCP與mFCP對肝臟和腎臟的指數影響差異不顯著（P＞0.05）。

2.6 FCP和mFCP預防鎘誘導的肝臟功能損傷

如圖5所示，相比對照組，鎘暴露組小鼠血漿中AST、ALT、γ-GT、總膽紅素水平均極顯著上升（P＜0.01），說明鎘暴露誘導小鼠肝臟出現損傷。FCP和mFCP干預組小鼠的上述指標均極顯著低于鎘暴露組小鼠（P＜0.01），說明FCP和mFCP能夠預防鎘引起的肝臟損傷。另外，同劑量下，mFCP保護肝臟的效果略好于FCP。

圖5 鎘暴露及FCP、mFCP預防對小鼠肝臟功能的影響Fig. 5 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on liver function in mice

2.7 各組小鼠尿樣比較

圖6 各組小鼠尿樣比較Fig. 6 Urine samples from mice in each group

如圖6所示，相比對照組，鎘暴露組小鼠尿樣顏色較深且渾濁，而FCP和mFCP干預組小鼠尿樣顏色較為清亮透明。說明鎘灌胃可能導致小鼠腎臟功能出現損傷，而FCP和mFCP預防處理后，有很好的緩解作用。

2.8 FCP和mFCP預防鎘誘導的腎臟功能損傷

如圖7所示，相比對照組，鎘暴露組小鼠血漿中肌酐、尿素氮水平以及尿蛋白水平均極顯著上升（P＜0.01），說明鎘暴露誘導小鼠腎臟功能出現損傷。FCP和mFCP干預組小鼠的上述指標均極顯著低于鎘暴露組小鼠（P＜0.01），說明FCP和mFCP能夠預防鎘引起的腎臟損傷。另外，同劑量下，mFCP保護腎臟的效果相較于FCP無顯著性差異（P＞0.05）。

圖7 鎘暴露及FCP、mFCP預防對小鼠腎臟功能的影響Fig. 7 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on kidney function in mice

2.9 鎘暴露對肝腎形態學影響及FCP和mFCP的預防作用

圖8 鎘暴露及FCP、mFCP預防對小鼠肝臟形態學特征的影響（400×）Fig. 8 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on morphological features of liver in mice (400 ×)

如圖8所示，對照組小鼠肝組織結構正常，肝細胞以血管為中心，向周圍呈放射狀排列，肝索清晰可見，細胞核膜明顯。鎘暴露小鼠肝細胞排列紊亂，肝索不明顯，細胞核膜不清晰，細胞質呈氣球樣病變，細胞質流失，炎性細胞浸潤。FCP和mFCP干預組小鼠肝臟上述病例現象不明顯，說明FCP和mFCP對肝臟起到很好的保護作用。

圖9 鎘暴露及FCP、mFCP預防對小鼠腎臟形態學特征的影響（400×）Fig. 9 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on morphological features of kidney in mice (400 ×)

如圖9所示，對照組小鼠腎臟組織結構正常，腎小球形態飽滿。鎘暴露小鼠腎小球出現明顯萎縮現象。FCP和mFCP干預組小鼠腎臟腎小球萎縮不明顯。說明FCP和mFCP對腎臟起到很好的保護作用。

2.10 鎘暴露對肝腎氧化還原指標的影響及FCP和mFCP的預防作用

表3 鎘暴露及FCP、mFCP預防對小鼠肝臟抗氧化能力的影響Table 3 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on antioxidant capacity of liver in mice

如表3、4所示，鎘暴露導致小鼠肝臟和腎臟NO水平和MDA水平極顯著上升（P＜0.01），說明肝臟和腎臟出現了明顯的氧化損傷。FCP和mFCP預防處理能夠顯著緩解鎘暴露引起的肝腎氧化損傷。另外，與對照組相比，鎘暴露組小鼠肝臟和腎臟的T-AOC及抗氧化酶（SOD、CAT、GPx）活力極顯著下降（P＜0.01）。FCP和mFCP干預組小鼠肝臟和腎臟的T-AOC及抗氧化酶活力極顯著高于鎘暴露組小鼠（P＜0.01）。說明FCP和mFCP能有效緩解鎘暴露引起的小鼠肝腎抗氧化能力下降。

表4 鎘暴露及FCP、mFCP干預對小鼠腎臟抗氧化能力的影響Table 4 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on antioxidant capacity of kidney in mice

2.11 各組小鼠尿液、血液、糞便、組織中鎘含量比較

表5 鎘暴露及FCP、mFCP預防對小鼠尿液、血液、糞便、組織中鎘含量的影響Table 5 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on cadmium levels in urine, blood, feces, and tissues in mice

由表5可見，鎘暴露組小鼠尿液、血液、肝臟、腎臟中鎘含量極顯著高于CON組小鼠（P＜0.01），進行FCP和mFCP預防后，尿液、血液、肝臟、腎臟中鎘的含量極顯著低于鎘暴露組小鼠（P＜0.01）。與之相反，FCP和mFCP預防組小鼠的糞便中鎘的含量極顯著高于鎘暴露組小鼠（P＜0.01）。說明FCP和mFCP在胃腸道內結合鎘后以糞便的形式排出體外。

3 討 論

目前，有關柑橘果膠的研究發現，柑橘水果的果皮和果肉中的果膠具有很強的重金屬吸附能力[15]。然而，有關柑橘果膠的鎘吸附能力的研究還比較少，且果膠的重金屬吸附能力主要應用在污水處理方面，在食品工業方面的研究還很少。提取佛手皮渣果膠，既能解決佛手相關產品生產造成的環境污染問題，又可以提高佛手的工業利用價值。本研究通過體外和體內實驗證實佛手皮渣果膠具有非常好的吸附鎘的能力；因此，本研究為將來佛手皮渣果膠在食品工業的應用提供可能，能夠降低鎘污染通過食物鏈對人體造成的傷害。

果膠對重金屬吸附主要依賴于其結構中存在的大量活性基團，如羥基、羧基等。其中，果膠中游離羧基的含量對其重金屬吸附能力起到決定性作用，果膠吸附重金屬的能力與其分子的酯化度有關，酯化度越低則重金屬吸附能力越強[35-36]。改性果膠在水溶液中有較多的游離羧基陰離子，每個陰離子都需要與陽離子結合形成穩定的“蛋殼”結構。毒性重金屬通常含有更多的電荷，因此具有比鈉、鉀等金屬離子更強的與羧基陰離子結合的能力。重金屬與果膠結合后，以糞便的形式排出體外[37]。本研究中，通過改變pH值的方法，佛手皮渣果膠的酯化度顯著下降，FT-IR結果證實佛手皮渣果膠改性后，其結構中游離羧基數量增加。另外，有研究認為，果膠對重金屬的吸附作用機理可以歸結為離子交換和表面吸附[38]。本實驗通過熱力學研究，證實佛手皮渣果膠對鎘的吸附同樣涉及離子交換和物理吸附。

肝臟是鎘暴露的主要攻擊器官，大量研究發現，鎘暴露會導致肝臟出現腫脹，以及血液中ALT和AST水平升高現象[39]。肝臟指數是反應肝細胞膜損傷和炎性浸潤的重要指標。ALT和AST分別存在于肝細胞的胞液和線粒體中，當肝功能損傷，肝細胞壞死時，ALT和AST會釋放進入血液。肝臟對膽紅素的代謝起著重要作用，肝功能一旦發生障礙，可導致膽紅素在血液中含量急劇上升。另外，血液中γ-GT水平的升高也反映了肝組織的損傷。本研究中，鎘暴露導致小鼠血液中ALT、AST、總膽紅素、γ-GT水平顯著高于對照組小鼠，說明鎘暴露導致小鼠出現肝損傷。形態學結果也證實以上結論。FCP和mFCP預防處理能夠顯著緩解鎘暴露導致的肝功能損傷。腎臟也是鎘的主要攻擊器官。研究發現，鎘暴露會導致腎臟出現萎縮現象，血液中尿素氮、肌酐水平，以及尿液中蛋白的含量會顯著上升[40]。本研究中，鎘暴露導致小鼠血液中尿素氮、肌酐水平顯著上升，而尿液中的蛋白含量也顯著上升。結合腎臟石蠟切片結果以及小鼠尿液顏色結果，證實鎘暴露導致小鼠腎臟損傷。不同劑量FCP和mFCP預防處理后，能夠顯著降低鎘引起的腎臟損傷的程度。

機體自身的抗氧化能力主要依賴于細胞內的抗氧化酶系，包括SOD、CAT、GPx等。研究發現，鎘進入體內后，可以和抗氧化酶結構中的二價金屬離子發生競爭性作用，從而降低抗氧化活力[41]。NO是L-精氨酸在一氧化氮合酶的作用下生成的，NO過高可直接導致線粒體呼吸鏈受阻，導致組織細胞內能量代謝障礙，引起細胞凋亡[42]。脂質過氧化產物MDA也是細胞氧化損傷的重要檢測指標。本研究中，鎘暴露導致小鼠肝臟和腎臟NO和MDA含量顯著上升，說明出現氧化損傷。另外，抗氧化酶活力顯著下降，說明抗氧化能力下降。然后，FCP和mFCP預防處理能有效緩解鎘暴露引起的肝腎抗氧化能力下降，減弱氧化應激損傷。

果膠的生理活性及功能與其特定結構有關，溶解性差、腸道吸收困難等因素嚴重制約了果膠的擴展應用[43]。目前，已有臨床研究將小分子改性果膠通過口服的形式治療重金屬超標引起的疾病，能夠有效降低患者血液中重金屬的含量[44]。說明通過適當的改性，可以將果膠的分子質量降低至腸道能夠吸收的級別。然而，本實驗中，Ussing-Chamber體外模擬體系結果顯示，本實驗制得的佛手皮渣果膠及其改性產物并不能通過腸道被機體吸收。結合糞便中鎘含量的測定結果，本實驗制得的佛手皮渣果膠和改性佛手皮渣果膠能夠有效結合胃腸道內的鎘，避免鎘透過腸壁進入內循環，并以糞便的形式排出體外，從而緩解鎘對機體的損傷。

綜上所述，通過pH值改性手段能夠顯著降低佛手皮渣果膠的酯化度，提高其對鎘的吸附能力。此外，佛手皮渣果膠和改性佛手皮渣果膠能夠拮抗鎘毒性，降低鎘引起的肝腎氧化損傷和功能缺失。今后研究將重點關注佛手皮渣果膠對鎘誘導的肝腎損傷相關機制和劑量選擇，并通過改性條件優化降低佛手皮渣果膠的分子質量，提高其在腸道的吸收率，從而進一步提高佛手加工的附加價值。