Trichothecium roseum 菌絲體細胞壁提取物對蘋果青霉病的控制效果及其誘導抗病機理

張彥東，胡文瑾，李永才*，畢 陽，張婷婷，胡培芳

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070 ）

我國已成為最大的蘋果生產國，蘋果種植面積和產量均居世界首位[1]。擴展青霉（Penicillium expansum）引起的蘋果青霉病是貯藏期常見的一種侵染性病害[2]，會造成較大的經濟損失。雖然采用化學殺菌劑可有效抑制蘋果的青霉病，但由于存在藥物殘留、環境污染以及病原物產生抗藥性等問題，其應用逐漸受到限制[3]；因此開發抑制蘋果采后病害的安全防腐劑和綜合防控技術已勢在必行。

生物源激發子是指來源于微生物、寄主植物和非寄主植物中的具有誘導植物產生防衛反應的活性物質，這些物質主要為寡糖類、糖蛋白類、蛋白多肽類及脂類化合物[4-5]。其中真菌源激發子作為一種信號分子可以引發植物體內抗性相關酶活力和基因表達量增加，激發植物體內的代謝調控，進而誘導植物產生抗性[6]。研究發現：灰葡萄孢（Botrytis cinerea）菌絲細胞壁提取物處理能提高葡萄中抗性相關酶活力及抗病相關物質的含量，有效地降低采后病害的發生[7]；B. cinerea中的14 kDa激活蛋白PEBCZ處理能提高番茄幼苗對灰霉病的抗性和防御相關酶活力[8]；B. cinerea分泌的蛋白激發子BcSpl也能誘導番茄抗病相關基因轉錄水平上調[9]；粉紅單端孢（Trichothecium roseum）蛋白激發子處理不僅可顯著抑制損傷接種杏果實黑病斑的擴展[10]，還能通過提高馬鈴薯切片中苯丙烷代謝關鍵酶的活力[11]和誘導抗性相關基因表達的上調[12]來提高馬鈴薯的抗病能力；從稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中分離得到的分泌型蛋白類激發子MoHrip1可提高水稻對稻瘟病菌和白葉枯菌的抗性[13]。可見真菌源激發子在采前和采后病害控制中具有良好的應用前景，但其作用效果和機理因來源真菌、控制病害、寄主等因素而異，需要針對不同來源真菌激發子、不同寄主病害進行具體研究，以闡明其作用的特異性。因此本實驗以‘紅富士’蘋果為試材，擬研究采后T.roseum源激發子處理對損傷接種P. expansum的蘋果果實青霉病的控制效果，初步探討誘導抗性作用機制，以期為真菌源激發子在果蔬采后病害控制中的應用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試蘋果（品種‘紅富士’）于2016年10月采自甘肅白銀市景泰縣條山農場，選取成熟度大致相同、無病蟲害、大小均勻一致的果實貯藏于4 ℃冷庫下待用。

葡萄糖、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na） 國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉、Tween-80 北京Solarbio公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 天津市光復科技發展有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP） 上海索寶生物科技有限公司。

T. roseum分離自貯藏期的甜瓜；P. expansum分離自貯藏期的蘋果。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；CX21FSIC光學顯微鏡 日本奧林巴斯工業有限公司；UV2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；H-1850R型臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機有限公司；1510-04087型酶標儀 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 T. roseum菌絲體細胞壁提取物的制備

1.3.1.1 T. roseum菌絲體的培養

將T. roseum接種于馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培養基上，25 ℃下培養7 d，然后取直徑為5 mm左右的菌餅，將其轉入PDB液體培養液中，在轉速為120 r/min的搖床上培養3 d，將培養的真菌培養液用真空泵抽濾得到菌絲體。

1.3.1.2 T. roseum菌絲體的純化

參照Ayers等[14]的方法并進行改進。首先，將菌絲體用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7）洗滌3 次，再懸浮于磷酸鹽緩沖液（含體積分數0.5% Triton-100）中，200 r/min勻漿3～5 min，中間每隔1 min間歇1 次；隨后在轉速為4 000 r/min的條件下離心10 min，取沉淀用體積分數為95%乙醇溶液洗滌3 次，之后對其進行離心并用蒸餾水洗滌3 次。

1.3.1.3 T. roseum菌絲體細胞壁提取物的制備

菌絲體經超聲波搗碎機進行多次搗碎，然后按照Ayers等[14]的方法獲取得到菌絲體細胞壁，然后將菌絲體細胞壁按1∶200（m/V）與去離子水進行混合，在高壓滅菌鍋中高溫水解3 h，冷卻后在轉速為12 000 r/min件下離心20 min。過濾收集濾液為菌絲體細胞壁提取物。

1.3.2 病原菌P. expansum的分離、純化

參照李永才[15]的方法并略作修改。采集有青霉病的果實，用體積分數75%乙醇溶液進行果實表面消毒，再用無菌水沖洗后切取病間交界處的組織，在無菌操作條件下移至PDA培養基上，然后放于25 ℃保溫培養，待其長出分生孢子之后再進行分離、純化，并通過回接實驗確定其致病性。分離純化的病原物在PDA培養基上保存備用。

1.3.3 P. expansum孢子懸浮液的配制

參照高春麗等[16]的方法并略作修改，無菌操作條件下用接種針挑取培養7 d的P. expansum并放于含有無菌水的三角瓶中，加入少量體積分數0.01% Tween-80，在混合器上振蕩15 s，再將所得溶液通過4 層紗布過濾，用無菌水稀釋，用血球計數板計數，配制成1×106個/mL孢子懸浮液。

1.3.4 T. roseum菌絲體細胞壁提取物對蘋果青霉病控制效果最佳質量濃度的確定

參照Moscoso-Ramírez等[17]的方法并修改。果實采收后，選取大小均勻、無病蟲害、機械損傷的果實，用體積分數75%乙醇溶液進行表面擦拭消毒，分別用0（對照）、50、100、150、200 mg/mL T. roseum菌絲體細胞壁提取物浸泡蘋果果實15 min，自然晾干。處理24 h后，用已滅菌的鐵釘（d＝3 mm）在果實赤道部位均勻打孔3 個（深3 mm），晾干后用移液槍吸取20 μL P. expansum孢子懸浮液，接入孔內，室溫下晾干后，裝入保鮮袋中，在室溫（25±2）℃、相對濕度45%～55%下貯藏，接種2 d后每隔1 d觀察并測定果實表面的病斑直徑，然后根據病斑直徑確定細胞壁提取物的最佳處理質量濃度，并以該質量濃度進行后續的實驗。每個處理用蘋果9 個，重復3 次。

1.3.5 樣品處理

選取用體積分數75%乙醇溶液表面消毒并晾干的果實，用滅菌鐵釘（直徑3 mm）在果實表面沿赤道部位均勻打孔4 個（深3 mm），待晾干后用移液槍向孔內注入20 μL 150 mg/mL T. roseum菌絲體細胞壁提取物，以注入清水作為對照，常溫貯藏2 h后再注入20 μL P. expansum孢子懸浮液，晾干后裝入包裝箱，上覆聚乙烯塑料薄膜（厚0.01 mm）于常溫條件下貯藏14 d待用，每組處理100 個果實，重復3 次。每隔2 d取樣，在離病斑邊緣1～2 cm的赤道部位表皮下1～5 mm處，用已消毒的不銹鋼刀切取果肉組織4 g，然后錫箔紙包好用液氮進行速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱內待測。

1.3.5.1 POD、PPO活力的測定

參照Yuan Li等[18]的方法并作修改。過氧化物酶（peroxidase，POD）以每分鐘內在470 nm波長處的吸光度變化0.01為1 個酶活力單位（U）；多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）以每分鐘內在420 nm波長處吸光度變化0.01為1 個酶活力單位（U）。單位均為U/g，結果以鮮質量計，樣品均重復測定3 次。

1.3.5.2 PAL活力的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活力測定參照曹建康等[19]的方法并略作修改。取冷凍的果肉組織3 g，加入100 mmol/L硼酸緩沖液5 mL（pH 8.8，含1 g/100mL PVP、1 mmol/L EDTA-2Na和50 mmol/L β-巰基乙醇），冰浴條件下充分研磨，于4 ℃ 11 250 r/min離心20 min，上清液立即用于酶活力的測定。取3 支試管分別標記為I、II和III，然后向I和II分別加入3 mL 7 mmol/L L-苯丙氨酸溶液（用50 mmol/L硼酸緩沖液配制），再分別向I和III中加入500 μL上清液，立即于37 ℃保溫1 h，保溫完畢后立即在290 nm波長處測定其吸光度，以II和III混合后測定的吸光度為初始吸光度，I中測定的吸光度為終止吸光度。另外以提取液代替上清液按照上述方法測得的吸光度分別作為初始吸光度和終止吸光度的對照，以每分鐘吸光度變化0.01為1 個PAL活力單位（U），單位為U/g，結果以鮮質量計，重復測定3 次。

1.3.5.3 4CL活力的測定

4-香豆酰-輔酶A連接酶（4-coumaryl coenzyme A ligase，4CL）活力測定參照Liu Yaoyao等[20]的方法并修改。取冷凍的蘋果組織3 g，加入5 mL 4 ℃預冷的0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，含體積分數25%甘油和0.1 mol/L二硫蘇糖醇），冰浴下充分研磨成勻漿，然后采用4 層紗布進行過濾，濾液在4 ℃、11 250 r/min下離心20 min，上清液用于4CL活力的測定。以每分鐘內在333 nm波長處吸光度變化0.01為1 個酶活力單位（U），單位為U/mg（以蛋白質量計）。參照Bradford[21]的方法，以牛血清白蛋白作標準曲線，計算蛋白質量濃度。重復測定3 次。

1.3.5.4 C4H活力的測定

本文選用特征參數主要包括時間參數、幅度參數、面積參數以及人體心率，如圖2所示。時間參數有收縮期時間占比t1t、舒張期時間占比t2t；幅度參數有降中峽相對高度h2h1，重搏波相對高度h3h1。面積參數有脈搏波特征值，其中SABCU表示ABCU 4個點圍成的面積。面積參數采用微元法進行計算，令一個t時間內的脈搏波ABC段有N1個樣本點，CDE段有N2個樣本點。時間元Δt=1/fs，則K1和K2的計算分別，如式（5）與（6）所示。由于信號的歸一化操作h1=1。

肉桂酸羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）活力的測定參照Lamb等[22]的方法并修改。取冷凍的果肉組織3 g，冰浴下充分研磨，之后加入5 mL 4 ℃預冷的提取液（50 mmol/L pH 8.9 Tris-HCl、4 mmol/L MgCl2、15 mmol/L?β-巰基乙醇、10 μmol/L亮抑酶肽、5 mmol/L還原型抗壞血酸、1 mmol/L苯甲基磺酰氟和1.5 g/100mL PVP、體積分數10%甘油），混勻后超聲波破碎2 min，然后用4 層紗布過濾，濾液4 ℃ 9 000 r/min離心20 min，上清液即可用于C4H活力的測定。C4H以每小時溶液在340 nm波長處吸光度變化0.01為1 個酶活力單位（U），單位為U/mg（以蛋白質量計）。重復測定3 次。

1.3.5.5 CAD活力的測定

肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活力的測定參照Goffner等[23]的方法并作修改。取冷凍的果肉組織3 g，加入5 mL 4 ℃預冷的0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.25，含15 mmol/L β-巰基乙醇、2 g/100 mL聚乙二醇和1 g/100 mL PVP），冰浴下充分研磨成勻漿，在4 ℃、12 500 r/min下離心25 min，上清液用于CAD活力測定。CAD以每分鐘內340 nm波長處吸光度變化0.001為1 個酶活力單位（U），單位為U/g（結果以蛋白質量計）。重復測定3 次。

1.3.5.6 總酚、類黃酮含量的測定

總酚、類黃酮含量測定參照Pirie等[24]的方法并進行修改。取冷凍的蘋果果肉組織3 g，加入5 mL 4 ℃預冷的體積分數1% HCl-甲醇，冰浴下充分研磨成勻漿，移入10 mL的離心管內置于暗處4 ℃下提取20 min，然后9 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液分別在280 nm和325 nm波長處測定光密度值，以每克鮮質量樣品的光密度值表征總酚（OD280nm）、類黃酮（OD325nm）含量，重復測定3 次。

1.3.5.7 木質素含量的測定

木質素含量測定參照Morrison[25]的方法并進行改進。取冷凍的蘋果組織3 g，加入5 mL 4 ℃預冷的體積分數95%乙醇溶液，冰浴條件下充分研磨，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，過濾后取沉淀物用體積分數95%乙醇溶液洗滌3 次，乙醇與正己烷體積比為1∶2的溶液沖洗3 次，收集沉淀并將其置于60 ℃干燥至恒質量，然后將干燥物溶于1 mL溴化乙酰-冰醋酸（1∶4，V/V）溶液中，在70 ℃下水浴30 min，隨后加入1 mL 2 mol/L NaOH終止反應，再加入0.1 mL 7.5 mol/L羥胺鹽酸和2 mL冰醋酸，離心取上清液0.67 mL，用冰醋酸定容到10 mL，在280 nm波長處測定其光密度值，以每克鮮質量樣品光密度值表征木質素含量（OD280nm），重復測定3 次。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 T. roseum菌絲體細胞壁提取物處理對采后蘋果青霉病的控制效果

圖1 T. roseum菌絲體細胞壁提取物處理對蘋果青霉病的控制效果Fig. 1 Controlling effect of T. roseum hyphal cell wall extract on blue mold of apple

由圖1可知，不同質量濃度菌絲體細胞壁提取物處理的蘋果病斑直徑均顯著低于對照組（P＜0.05）。且隨處理質量濃度的增加，其抑制效果呈先升高后下降的趨勢，其中，150 mg/mL菌絲體細胞壁提取物處理控制效果最好，該組病斑直徑僅為對照組的29.5%；因此以150 mg/mL為最佳處理質量濃度。

2.2 T. roseum菌絲體細胞壁提取物處理對蘋果果實苯丙烷代謝關鍵酶活力及其產物含量的影響

2.2.1 對POD和PPO活力的影響

圖2 T. roseum菌絲體細胞壁提取物對蘋果組織POD（A）和PPO（B）活力的影響Fig. 2 Effect of T. roseum hyphal cell wall extract on POD (A) and PPO (B) activities in apple fruit

由圖2可知，蘋果果實組織POD和PPO活力在貯藏期間均呈先升高后下降的趨勢。150 mg/mL T. roseum菌絲體細胞壁提取物處理顯著提高了果實POD活力（P＜0.05）（圖2A），該組POD活力在第6天出現峰值，較同期對照組高80.0%。除第4天外，處理組蘋果組織PPO活力均顯著高于對照組（P＜0.05）（圖2B），且在第10天出現峰值，較同期對照組高63.3%，隨后逐漸下降。以上結果說明菌絲體細胞壁提取物處理對PPO、POD活力具有一定的促進作用。

2.2.2 對PAL、C4H、4CL和CAD活力的影響

圖3 T. roseum菌絲體細胞壁提取物對蘋果組織中PAL（A）、C4H（B）、4CL（C）和CAD（D）活力的影響Fig. 3 Effect of T. roseum hyphal cell wall extract on PAL (A), C4H (B),4CL (C) and CAD (D) activities in apple fruit

由圖3可知，除4CL外，蘋果果實組織PAL、C4H和CAD活力隨貯藏時間延長均呈先升高后下降的趨勢，并且處理組的這4 種酶活力整體上均顯著高于對照組（P＜0.05），說明菌絲體細胞壁提取物處理對酶活力均有一定的促進作用。150 mg/mL T. roseum菌絲體細胞壁提取物處理組果實PAL活力在第6天出現峰值，較同期對照組高出21.2%（圖3A）。對于C4H活力，對照組在8 d后下降，而處理組繼續升高，12 d后達到穩定（圖3B）。處理組果實在貯藏6 d后，4CL的活力隨著貯藏時間的延長呈逐漸升高的趨勢，但對照組在貯藏2 d后總體呈下降趨勢（圖3C）。另外，處理組果實組織CAD活力在第8天達到最大值，為同期對照組的1.2 倍（圖3D）。

2.2.3 對總酚、類黃酮和木質素含量的影響

圖4 T. roseum菌絲體細胞壁提取物對蘋果組織中總酚（A）、類黃酮（B）和木質素（C）含量的影響Fig. 4 Effect of T. roseum hyphal cell wall extract on the contents of total phenolic (A), flavonoids (B), and lignin (C) in apple fruit

由圖4可知，貯藏期間，蘋果組織中總酚、類黃酮和木質素的含量整體呈先上升后下降的趨勢，且處理組各物質含量均高于對照組，說明150 mg/mL T. roseum菌絲體細胞壁提取物處理顯著提高了蘋果組織的總酚、類黃酮和木質素含量（P＜0.05），并且均在第8天時達到峰值，分別較同期對照組增加了9.2%、6.8%和28.3%

3 討 論

本研究結果表明，采后T. roseum菌絲體細胞壁提取物處理對蘋果青霉病具有一定的控制作用，其中150 mg/mL T. roseum菌絲體細胞壁提取物處理能夠有效抑制損傷接種蘋果病斑面積的擴展，其抑制率達到29.5%。這與本課題組前期用T. roseum源激發子處理控制杏果黑斑病[10]和馬鈴薯干腐病[11-12]的結果一致，表明T. roseum源激發子對采后病害的控制具有廣譜性和良好的應用前景。同時有研究發現B. cinerea菌絲體細胞壁提取物處理可有效降低葡萄采后自然發病率[7]，且從該真菌中分離純化的14 kDa激活蛋白PEBC2處理可顯著降低番茄灰霉病的病葉率和發病率[8]，另外還發現馬鈴薯早疫病致病菌的胞壁提取物處理能降低馬鈴薯塊莖的早疫病病情指數[26]。可見細胞壁物質是真菌源激發子的主要來源，優化其提取工藝和使用條件對進一步開發應用具有十分重要的意義。

微生物源激發子可通過誘導植物組織抗性物質的產生和積累而對病害進行有效控制[27]，其中木質素、酚類及多種類黃酮類植保素等抗菌化合物的合成主要依賴于組織中的苯丙烷類代謝[28-29]。PAL是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶，可將苯丙氨酸轉化為肉桂酸[30]。C4H是苯丙烷代謝途徑中第二步反應的酶，是苯丙烷代謝的另一關鍵酶[31]。4CL是苯丙烷代謝總途徑中的最后一個酶，可催化各種羥基肉桂酸生成相應的硫酯，再通過一系列的反應最終合成木質素、酚類等防御物質[32]。同時，在植物次生代謝中，CAD也是木質素合成的關鍵酶，與植物生長發育和抵御病原菌入侵關系密切[33]。另外，在植物防御體系中抗性相關酶POD和PPO也發揮著積極的作用，其中POD參與了病原物入侵時植物組織中木質素的合成，從而加固細胞壁以抵抗病原物的入侵，PPO可以將細胞代謝產物中的酚類物質氧化為醌類來抑制病原物的侵染，從而起到抗病的作用[34-35]。研究發現Alternaria alternata (Fr.) Keissl菌絲細胞壁提取物處理能提高采后葡萄皮中抗性相關酶PAL、POD和PPO的活力及木質素、酚類物質含量[36]；B. cinerea中的14 kDa激活蛋白PEBCZ處理能提高番茄幼苗葉片中防御相關酶PAL、POD和PPO的活力[9]；接種稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）細胞壁來源的糖蛋白激發子CSBI后，水稻葉片內POD、PAL活力和木質素含量在互作早期已開始顯著增加[37]，另外還有研究表明T. roseum蛋白激發子處理不僅能顯著提高馬鈴薯切片中苯丙烷代謝關鍵酶PAL、POD和PPO的活力[11]，而且還能誘導馬鈴薯塊莖中苯丙烷途徑中3 個關鍵酶（PAL、4CL和C4H）活力的增強及其基因轉錄、表達的上調，進而促進了木質素、總酚、黃酮的積累[12]。大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）分泌蛋白PevDl能誘導棉花葉片抗性早期信號分子H2O2產生和NO積累，維管束細胞壁加厚、木質素和酚類物質的積累，還能提高防御相關酶PAL、POD和PPO活力以及棉花抗性基因和木質素合成相關基因PAL、C4H和4CL的轉錄水平[38]。本研究發現，T. roseum菌絲體細胞壁提取物處理能顯著提高采后‘紅富士’蘋果中PPO、POD活力以及誘導果實組織苯丙烷代謝相關酶PAL、C4H、4CL和CAD活力的增強，進而促進蘋果果實組織中總酚、類黃酮和木質素的積累。這些研究結果均顯示真菌源激發子可通過激活植物苯丙烷代謝，增加代謝相關酶的活力和抗性物質的積累來增加對病原物的抵抗能力，但真菌源激發子誘導植物抗病性的具體分子調控機制尚需進一步探討。

4 結 論

采后T. roseum菌絲體細胞壁提取物處理能夠有效抑制損傷接種P. expansum蘋果青霉病的擴展，其中以150 mg/mL T. roseum菌絲體細胞壁提取物處理效果為最好。進一步研究表明T. roseum菌絲細胞壁提取物可誘導采后蘋果（‘紅富士’）中PPO、POD、PAL、4CL、C4H和CAD活力的增加，進一步提高果實中抗病代謝產物總酚、類黃酮和木質素的含量。