禾花鯉與建鯉肌間骨miRNAs測序與分析比較

何蘋萍 王 卉 韋嬪媛 林 勇 黃 姻 王韶韶 彭金霞 吳鐵軍

(廣西水產(chǎn)科學研究院, 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室, 南寧 530021)

鯉(Cyprinus carpio)是目前世界上養(yǎng)殖歷史最悠久, 養(yǎng)殖范圍最廣的淡水魚類, 是許多國家的主要養(yǎng)殖品種[1], 在漫長的自然演化和人工馴養(yǎng)背景下, 形成了許多著名的鯉品種, 如黃河鯉、建鯉、黑龍江鯉等。廣西全州禾花鯉(又名禾花魚), 是最具廣西地方特色的稻魚共養(yǎng)品種, 也是鯉的一個獨特的地方土著品種。禾花鯉因經(jīng)稻田長期馴化, 食禾花而得名, 它體型粗短、鱗細皮薄、肉質(zhì)細嫩、味道鮮美, 特別是肌間骨柔軟細小且可食用, 清代乾隆年間曾成為宮廷貢品。建鯉是以荷包紅鯉和沅江鯉為親本選育的良種, 生長速度快、抗病能力強、含肉多。建鯉是我國養(yǎng)殖鯉魚的代表性品種之一, 在我國廣泛養(yǎng)殖[2,3]。

魚類的骨骼肌間骨又稱為肌間刺, 是位于脊椎骨兩側(cè)肌間隔中的硬骨小刺, 是由肌膈間的結(jié)締組織直接骨化而形成的[4]。肌間骨在低等真骨魚類中普遍存在, 隨著魚類的演化, 其形態(tài)逐漸復雜化[5]。眾多細小的肌間骨一直以來影響多種魚類的食用品質(zhì), 因此, 魚類肌間骨的形態(tài)和發(fā)育機制一直是水產(chǎn)研究的熱點。其中, 關(guān)于真骨魚類肌間骨的骨化模式研究主要集中在黃鱔(Monopterus albus)[6]、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)[7]、鯽(Carassius auratus)[8]、鯉(Cyprinus carpio)[9]和團頭魴(Megalobrama amblycephala)[10], 這些研究主要集中在肌間骨的形態(tài)、數(shù)量和分布等規(guī)律。而關(guān)于肌間骨發(fā)育分子調(diào)控研究的僅僅有羅非魚(Tilapia)[11]、鯉(Common carp)[11]和團頭魴(Megalobrama amblycephala)[12]。

小分子RNA(microRNA, miRNA)是一類進化保守的、內(nèi)源性的、非編碼的小RNA。miRNA通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)(Untranslated regions, UTR)結(jié)合從而抑制靶基因的翻譯或降解靶基因[13]。1993年在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)時序性發(fā)育調(diào)控過程中發(fā)現(xiàn)了首個miRNA(lin-4)[14];2000年又在線蟲中找到了第2個調(diào)控時序性發(fā)育的miRNA基因let-7[15]。miRNA參與許多重要的生物學過程, 如在個體發(fā)育、組織分化、病毒感染等逆境適應(yīng)過程中都具有重要作用。miRNA在魚類的研究比較多地集中于免疫[16]方面。近年來, miRNA在魚類發(fā)育過程中的作用也越來越受到重視, 魚類骨骼要經(jīng)歷軟骨化和硬骨化的過程, 受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控, 如Sox9[17]和Runx2[18]等。而miR-140[19]、miR-204[20]和miR-211[20]則調(diào)控上述斑馬魚骨化轉(zhuǎn)錄因子的表達。以上結(jié)果表明, miRNA是調(diào)控魚類骨骼形成的重要因素。研究發(fā)現(xiàn), miRNA一般是通過多個信號通路來調(diào)控骨骼發(fā)育[21]。但目前為止, miRNA在水產(chǎn)動物肌間骨發(fā)育中的作用研究僅僅在團頭魴中開展過[22,23]。

作為廣西稻田養(yǎng)魚的主要本地特色品種禾花鯉, 其相關(guān)的基礎(chǔ)研究十分缺乏。本研究針對禾花鯉肌間骨細小且柔軟可食用的特點, 開展其分子調(diào)控機制的研究。采集禾花鯉及建鯉的肌間骨進行miRNAs的高通量測序, 進行生物信息學比較分析,為禾花鯉肌間骨發(fā)育的分子調(diào)控機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究所用的實驗動物為來自全州的禾花鯉及來自南寧的建鯉(均為24月齡), 均暫養(yǎng)在溫度為25℃的水中。

1.2 組織樣本采集

分別采集禾花鯉及建鯉的肌間刺數(shù)根, 于液氮中速凍。

1.3 小RNA文庫構(gòu)建和測序

用EASYspin Plus骨組織RNA快速提取試劑盒分別提取禾花鯉及建鯉骨頭的總RNA, 隨后通過15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化16—30 nt的小分子RNA, 進行Solexa高通量測序。小RNA文庫的Solexa測序由武漢華大生物公司完成。

1.4 生物信息學分析

一般來說, 小RNA的長度區(qū)間為18—30 nt。在測序完成后, 首先進行序列去雜, 篩選一定長度范圍內(nèi)的sRNA, 用軟件bowtie (http://computing.bio.cam.ac.uk/local/doc/bowtie2.html#)將長度篩選后的sRNA定位到基因組參考序列上, 分析small RNA在參考序列上的分布情況, 然后將上述mapped到參考序列上的reads, 在Rfam (http://Rfam.sanger.ac.uk/)、miRBase (http://www.mirbase.org/)中進行比對, 得到各樣品匹配上的sRNA的詳細情況, 包括匹配上的已知miRNAs的二級結(jié)構(gòu), 各樣本中miRNAs的序列、長度、出現(xiàn)的次數(shù)等信息。進一步通過miRNAs前體的標志性發(fā)夾結(jié)構(gòu), 使用miRDeep2[24]預(yù)測新的miRNAs。對各樣本中已知和新miRNAs進行表達量的統(tǒng)計, 并用TPM進行表達量歸一化處理。參照Audic等[25]發(fā)表在Genome Research上的基于測序的差異基因檢測方法開發(fā)ExpDiff進行樣品間表達差異分析。根據(jù)差異miRNAs檢測結(jié)果, 使用R軟件中的pheatmap函數(shù)進行層次聚類分析。我們用miRanda[26]來對分析得到的已知、novel miRNAs進行靶基因預(yù)測。得到各組比較間的差異表達miRNAs后, 根據(jù)miRNAs與其靶基因間的對應(yīng)關(guān)系, 對每組差異表達miRNAs的靶基因的集合分別進行GO (Gene Ontology)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。

2 結(jié)果

2.1 小RNAs的基本特征

為了比較禾花鯉及建鯉肌間刺miRNAs的表達差異, 本研究分別從禾花鯉及建鯉肌間刺提取小RNA, 構(gòu)建了2個小RNA文庫。對這2個文庫進行Solexa測序, 分別產(chǎn)生約30179426和29750080條序列。去除低質(zhì)量序列、接頭序列和短序列后, 分別從禾花鯉和建鯉的肌間刺文庫中篩選出25474895和24625715條高質(zhì)量序列進行進一步的分析。結(jié)果表明, 禾花鯉以及建鯉小RNA長度主要分布在17—30個核苷酸, 其中21個核苷酸的小RNA最豐富, 其次是20個核苷酸、22個核苷酸(圖 1)。

2.2 MiRNAs的鑒定

在上述高質(zhì)量小RNA序列中, 禾花鯉與建鯉分別有20765041 (84.32%)和21326842 (83.72%)條序列與參考基因組比對成功。比對上的小RNA通過與Rfam、miRBase數(shù)據(jù)庫比對, 進行各種小RNA分類, 其中, 禾花鯉miRNAs占其小RNA總量的9.80%, 遠低于建鯉(40.2%, 圖 2)。從禾花鯉和建鯉中分別鑒定出已知的成熟miRNAs 595和570種。

2.3 MiRNAs的差異表達分析

通過比較樣品之間的表達量, 篩選差異表達miRNAs。我們采用ExpDiff進行差異miRNAs篩選。禾花鯉與建鯉相比, 一共有351個差異miRNAs,其中84個上調(diào)表達, 267個下調(diào)表達。部分顯著差異表達的miRNAs見表 1。

圖 1 小RNA長度分布Fig. 1 Length distribution of small RNA sequencesA. 建鯉; B. 禾花鯉A. Jian carp; B. Rice flower carp

圖 2 小RNA分類注釋Fig. 2 Classification annotation of small RNA sequencesA. 建鯉; B. 禾花鯉A. Jian carp; B. Rice flower carp

表 1 部分顯著差異表達及成骨發(fā)育相關(guān)的miRNAsTab. 1 Partial significantly differential expressed or osteogenesisrelated miRNAs

2.4 差異miRNAs的靶基因GO顯著性富集分析

我們用WEGO軟件對差異miRNA的靶基因做GO功能分類統(tǒng)計, 從宏觀上認識差異基因的功能分布特征, 部分結(jié)果展示如表 2。GO總共分為三大功能類, 分別描述基因的分子功能(Molecular function)、所處的細胞位置(Cellular component)和參與的生物過程(Biological process)。差異miRNA的靶基因注釋最多的為Biological process, 其中以細胞過程(Cellular process)為最多, 其次為單一組織過程(Single-organism process)、新陳代謝過程(Metabolic process)及生物調(diào)節(jié)(Biological regulation); Molecular function中以結(jié)合(Binding)及催化活性(Catalytic activity)為最多; Cellular component中以細胞(Cell)、細胞器(Organelle)為最多。

2.5 差異miRNAs的靶基因Pathway顯著性富集分析

在生物體內(nèi), 不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學功能, 基于Pathway的分析有助于更進一步了解基因的生物學功能。我們以KEGG公共數(shù)據(jù)庫對差異miRNAs作Pathway富集分析。圖 3顯示了排名前20的差異miRNAs的靶基因富集的Pathway。其中包括signaling pathways regulating pluriotency of stem cells (調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路)、axon guidance(軸突導向)等。

表 2 部分差異miRNAs靶基因的GO分類Tab. 2 Partial GO of differentially expressed miRNAs

圖 3 前20的差異miRNAs pathway富集統(tǒng)計散點圖Fig. 3 The top 20 pathways enriched by the putative target genes of the differentially expressed miRNAs

3 討論

Li等[27]發(fā)現(xiàn)在MC3T3細胞成骨分化過程中,miR-29b可以通過降解抑制成骨的靶基因HDAC4、TGF-β3、ACVR2A的表達促進成骨。團頭魴肌間骨中miR-29的表達量較結(jié)締組織中的低, 推測miR-29在團頭魴中可能起到抑制成骨的作用[23]。miR-29雖然與miR-29b為一個家族的成員, 但功能卻不同, 也可能是在不同物種中作用的差異。He等[28]發(fā)現(xiàn)miR-20b通過降低PPARγ的表達提高了成骨的核心轉(zhuǎn)錄因子Runx2轉(zhuǎn)錄, 促進成骨分化。有研究發(fā)現(xiàn)miR-27可以抑制靶基因APC, 從而反激活WNT促進成骨分化[29]。miR-210在ST2成骨分化過程中可能通過抑制成骨分化的重要基因AcvR1b來促進成骨[30]。Oskowitz等[31]則從由美國國立衛(wèi)生研究中心提供的MSCs其誘導分化的成骨細胞中,利用芯片篩選出在成骨細胞中高表達的miRNAs,如hsa-miR-130a、has-miR-199a、hsa-miR-346、hsa-miR-21及hsa-miR-10a等。在本研究中禾花鯉肌間骨中miR-29b、20b-5p、miR-27-3p、miR-210-3p、miR-130a、miR-199a及miR-21的表達與建鯉相比均為下調(diào)表達。這些均為上述已報道的促進人類成骨的miRNAs, 因此我們推斷禾花鯉通過下調(diào)表達促進成骨的miRNAs來抑制成骨。

Eskildscn等[32]發(fā)現(xiàn)miR-138通過抑制FAKERK1/2信號通路降低下游成骨的核心結(jié)合因子Runx2和OSX的表達來降低成骨作用。Li等[33]發(fā)現(xiàn)在BMP2誘導的C2C12細胞成骨分化中, 對其中顯著下調(diào)的miR-133和miR-135進行研究后發(fā)現(xiàn), miR-133的靶基因為Runx2, 而miR-135的靶基因為mad5,兩者共同作用來抑制骨的形成。團頭魴肌間骨中miR-133b的表達量隨著魚齡的增長呈增加的趨勢,推測miR-133b在團頭魴肌間骨的形成過程中起到促進的作用[28]。miR-133b雖然與miR-133為一個家族的成員, 但功能有所不同, 也可能是在不同物種中作用的差異。Wei等[34]發(fā)現(xiàn), miR-34b通過兩條途徑來抑制成骨, 一方面通過阻礙CDK4、CDK6和Cyclin D1蛋白表達來減少成骨細胞的數(shù)量; 另一方面通過降低SATB2蛋白的表達來抑制成骨細胞的分化。Gao[35]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-31、hsa-miR-106a、hsamiR-148a通過抑制BMSCs的分化來抑制成骨的過程。在本研究中禾花鯉肌間骨中的miR-133、miR-135、miR-34b、hsa-miR-31、hsa-miR-148a以及miR-138的表達與建鯉相比均為上調(diào)表達。這些均為上述已報道的抑制人類成骨的miRNAs, 因此我們推斷禾花鯉通過上調(diào)表達抑制成骨的miRNAs來達到抑制成骨的目的。

總之, 我們推測禾花鯉可能是通過下調(diào)表達促進成骨miRNAs及上調(diào)表達抑制成骨miRNAs來抑制成骨過程, 從而維持其肌間骨細小及柔軟的特性。該研究為禾花鯉肌間骨發(fā)育的分子調(diào)控機制研究奠定了基礎(chǔ)。