熒光探針法檢測活性羰基化合物甲醛的研究進展

吳少平, 阮淞淞, 宋歡歡

(西北大學 生命科學學院/糖生物學及藥物化學國際聯合實驗室, 陜西 西安 710069)

活性羰基物種(reactive carbonyl species, RCS)包括大量的含有一個或多個羰基的生物化合物,這些化合物在從細菌到人類的各種有機體中不斷產生。RCS是一種廣泛存在于生物生命中的化合物,可以是內源性化合物,也可以是外源性化合物。外源性來源包括一些RCS,如丙烯醛、巴豆醛、乙二醛、丙酮和甲醛等,它們是普遍存在的工業污染物,很容易從環境中進入細胞[1-3],其他外源性RCS包括有機藥物,香煙煙霧,食品添加劑和褐變食物的產物[4-9];內源性來源主要由細胞內多種不穩定的RCS很容易通過脂質過氧化、氨基酸氧化和糖基化等非酶過程產生[10-17]。

RCS主要包括甲醛(FA)、甲基乙二醛(MGO)、丙二醛(MDA)、丙烯醛、丙醛、乙二醛、乙醛、4-羥基壬烯醛、草酰乙酸、丙酮酸等[18]。正常情況下,RCS的穩態濃度保持在一定范圍內,當RCS水平發生變化,會導致機體發生病理變化。如活性羰基化合物穩態水平的增加是導致羰基應激、衰老、代謝綜合征的發病機制、與糖尿病和腎功能衰竭相關的慢性并發癥、神經退行性疾病和其他疾病的關鍵原因[10-11,19,25]。因此,羰基應激在許多慢性和退行性疾病中具有臨床意義,包括糖尿病、肥胖、腎臟和心臟疾病、動脈粥樣硬化和神經退行性疾病。另一方面,細胞中持續存在低濃度的RCS,可以認為是RCS作為免疫應答,基因表達調節因子和細胞信號傳導的重要組成部分的出現[10,12,25]。目前,已在生物樣本中確定了20多種RCS[12]。圖1顯示了在生物中檢測到的最常見的飽和RCS和不飽和RCS。因活性羰基物種對人類健康與環境的影響巨大,所以開發一種用于高效檢測活性羰基物種的技術手段極其重要。

甲醛(formaldehyde, FA)作為一種簡單的醛基化合物,因其含有活性極高的羰基,化學性質活潑,已被認為是從人類的自然毒物和致癌物,其主要釋放途徑包括生物質燃燒、腐殖質的日曬降解、植被和微生物的分解排放以及植被和微生物的產生;以及其他人為來源,如甲醛工業生產、汽車尾氣排放等[26]。根據IARC[27]定義,甲醛屬于第一類人類和動物致癌物,也是世界衛生組織(WHO)確認的第三大室內污染物,它不僅是各種材料和化學物質中所含的室內污染物,而且是一種天然化合物和人為產物[28-29]。甲醛廣泛應用于各個領域,如材料、涂料、農藥、化妝品、藥品等行業。同時,由于甲醛具有出眾的DNA和蛋白質交聯特性,這也使得其成為一種性能出眾的組織固定劑和防腐劑[26,30-31]。與此同時,甲醛卻也是一種常見的內源性生化反應產物,體內正常穩定的甲醛含量對于人體的健康有著非常重要的意義。外源性的甲醛可通過呼吸作用、皮膚滲透或其他渠道進入人體后會對人體的健康造成損害,引起多種疾病[32],如心臟疾病[33]、阿爾茨海默病[33]、癌癥[34]。若過量攝入會對中樞神經系統造成損害導致記憶力和認知能力下降[33,35],甚至可能危及生命[36,38]。內源性醛是一類活性很強的分子,因為它們會導致醛-DNA加合物的形成,從而導致許多疾病,如酒精相關疾病、阿爾茨海默病、痛覺過敏和腎病[37]。甲醛可以通過中性粒細胞酶髓過氧化物酶,氧化酶和去甲基化的作用內源性地產生,這是一種常見的生化過程[38]。

圖1 常見的生物活性羰基物種的結構Fig.1 Structures of common biological reactive carbonyl species

研究表明,在健康的人體大腦中,甲醛含量在0.2～0.4 mmol/L的范圍內,同時大腦中的甲醛通過參與DNA脫甲基化,可以起到存儲、保護、檢索以及恢復長期記憶的作用[39]。人血中甲醛的正常水平為0.06～0.08 mmol/L[40]。而在細胞當中,在甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase)、S-硝基谷胱甘肽還原酶(S-nitro-soglutathione reductase)以及乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2)等酶的作用下,甲醛在細胞內濃度為400 μM[41,44]。已知較高水平的甲醛可導致各種疾病,如呼吸系統疾病[45]、畸形胚胎[46]、慢性肝臟及心臟疾病[47]、糖尿病[48]、阿爾茨海默病[47,49]和癌癥[37,50-51]。所以,對環境及生物體內甲醛的準確定量檢測有著非常重要意義,這也使得近年來對甲醛的檢測與研究逐漸成為研究熱點。甲醛普遍存在于空氣、水和工業產品中。因此,大氣中痕量甲醛的定量測定可能是環境污染中最具挑戰性的問題,也是最常見的問題。上述問題不僅在公共衛生方面發揮著雙重作用,而且在工業發展中也起著雙重作用。因此，開發高效、高靈敏度、高選擇性的化學傳感器等簡便、選擇性、可靠的甲醛檢測方法已成為當務之急。

目前常見的檢測甲醛方法主要有放射性試驗法(radiometric assays)[52],高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)[53],選擇離子流動管質譜法(selected ion flow tube mass spectrometry,SIFT-MS)[54]以及化學衍生氣相色譜法(GC analyses following chemical derivatization)[55]等。然而，上述這些方法的不足是顯而易見的,它們的選擇性及靈敏度仍有待提高且會對活體細胞及組織造成無法修復的損害。而熒光探針具有實時性、較高的靈敏度和選擇性,低生理學毒性且具有單一選擇性及強抗干擾性等優點使得其在甲醛的檢測上有著無可比擬的優勢,是生物小分子檢測和酶活性檢測的首選分析工具[56,62]。因此,發展利用熒光探針對甲醛進行檢測的熒光光譜法得到了廣泛的重視和越來越多的研究。

近年來關于檢測甲醛的熒光探針越來越受到研究人員的重視并得到了越來越廣泛的研究與應用。同時,關于甲醛探針的報道越來越多,本文基于甲醛與探針分子間的反應類型,總結了常見的用于檢測甲醛的熒光探針小分子,并對探針分子的識別機理及應用進行了總結與歸納。

1 基于Aza-cope重排反應的探針

Aza-cope重排反應是有機化學中的重要合成方法。1,5-二烯類化合物在受熱條件下發生[3,3]-σ遷移的反應稱為Cope重排。而氮雜的1,5-二烯在加熱條件下通過[3,3]-σ重排異構化的反應被稱為aza-Cope重排反應。Aza-cope重排反應機理見圖2。

圖2 Aza-cope重排的機理Fig.2 Mechanism of aza-cope reaction

2015年Chang[63]課題組設計利用甲醛誘導的2-aza-Cope重排反應的“Turn-on”型探針1(如圖3所示),這是第一代基于aza-Cope重排反應的熒光探針,可用于檢測活細胞中的甲醛。探針1以氨基甲基硅羅丹明染料為骨架,連有一個高烯丙基胺基和一個閉合的五元環。探針1在pH 7.4的磷酸鹽緩沖液的水溶性良好,并且有微弱熒光,其熒光量子產率(Φ)為0.36。加入甲醛后探針在645 nm處的熒光強度隨著時間逐漸增強。當探針1與甲醛反應時,形成亞胺中間體,隨后發生高烯丙基胺基的2-aza-Cope重排和水解產生了熒光較強的醛產物。探針1對甲醛表現出良好的選擇性和高靈敏度。此外,探針1能夠檢測活細胞中的外源性甲醛和人胚腎細胞(HEK293TN cells)中賴氨酸特異性蛋白酶去甲基化產生的內源性產生的甲醛。探針1在活細胞中檢測甲醛的應用,為在表觀遺傳,衰老和病理生理過程中探測活性羰基化合物提供了研究方向。

圖3 探針1的結構及對甲醛的檢測機理Fig.3 Structure of probe 1 and detection mechanism of formaldehyde

Roth和Chan[64]課題組等于2015年設計了一種基于2-aza-Cope重排反應,以硅羅丹明為骨架合成檢測活細胞中FA的探針2(如圖4所示)。探針2由3部分組成:黑色為羅丹明結構的熒光團,藍色為FA識別基團,紅色為猝滅基團。為了優化檢測的靈敏度加入了4-硝基芐基,通過光誘導電子轉移(d-PeT)降低探針2的背景熒光。在FA存在下,探針2通過可逆縮合反應生成一種亞胺中間體,該中間體可以通過電荷促進[3,3]-σ鍵遷移重排,水解使4-硝基芐基離去,阻斷了a-PeT過程,得到強熒光性質的醛產物。探針2對FA有良好的選擇性和高的靈敏度,可用于人胚腎細胞(HEK293TN cells)和小鼠骨髓瘤細胞(NS1 cells)的活細胞成像。此外,探針2具有很好的光穩定性,在延時成像實驗中,可以實時捕捉探針2與FA之間的反應。探針2為闡明FA在活細胞中的生理作用提供了技術手段。

與傳統的單光子成像技術相比,雙光子成像利用兩個近紅外激光來激發熒光探針,具有比單光子更少的光漂白、光毒性、細胞自發熒光和組織穿透性好等優點。Li和Yuan等[65]于2016年設計了一種基于2-aza-Cope重排反應的“Turn-on”型雙光子熒光探針3(如圖5所示),它可以選擇性和靈敏地檢測甲醛。探針3以萘衍生物作為熒光團(黑色部分),高烯丙基胺基作為甲醛的識別基團,又引入硝基芐基作為猝滅基團(紅色部分),采用d-PeT來降低探針的背景熒光。探針3本身幾乎沒有熒光,當與甲醛反應時,形成亞胺中間體,隨后高烯丙基胺基重排和水解,生成具有D-π-A結構的雙光子熒光產物“開啟”熒光。探針3有良好的光物理性質,在pH 2.0～10.0范圍內有較高的選擇性,其檢測限為0.2 μmol/L。此外,探針3具有良好的光穩定性,可用于活細胞中外源性和內源性甲醛的檢測,并且具有較低的細胞毒性和自熒光性。探針3有良好的組織穿透和染色能力,適用于組織水平的甲醛的檢測。這些研究都表明探針3在生物內檢測甲醛分子具有廣闊的應用前景。

圖4 探針2的結構及對甲醛的檢測機理Fig.4 Structure of probe 2 and detection mechanism of formaldehyde

圖5 探針3的結構及對甲醛的檢測機理Fig.5 Structure of probe 3 and detection mechanism of formaldehyde

2016年Bruemmer和Chang課題組[66]等基于2-aza-Cope重排反應在4-OMe-Tokyo Green(TG)熒光骨架上設計了一種可在活細胞中檢測甲醛的探針4(如圖6,7所示)。探針4通過游離酚類基團來阻礙熒光團呫噸酮部分的共軛作用,從而使探針本身沒有熒光。當與甲醛反應時,探針4中的高烯丙基胺通過aza-Cope重排形成亞胺,隨后探針發生自分解和水解生成一種熒光較強的酚鹽和副產物高烯丙基胺以及丙烯醛。因此,基于2-aza-Cope重排反應,通過自分解將含酚的熒光團釋放來選擇性檢測甲醛的熒光探針將成為一種新的設計思路。

圖6 探針4的檢測機理Fig.6 Detection mechanism of probe 4

圖7 探針4的結構及對甲醛的檢測機理Fig.7 Structure of probe 4 and detection mechanism of formaldehyde

圖8 探針5的結構及對甲醛的檢測機理Fig.8 Structure of probe 5 and detection mechanism of formaldehyde

2016年He和Lin課題組[67]等設計并合成了一種基于6-羥基萘為熒光團的甲醛比率型熒光探針5(如圖8所示)。探針5在含1%(體積分數)丙酮的磷酸鹽緩沖液(25 mmol/L, pH 7.4)中與甲醛反應后,在359 nm處的熒光強度逐漸減低,而在451 nm處的熒光強度顯著增強,在發射譜上產生了明顯的紅移(92 nm),兩個不同的發射峰(I451/I359)的比值顯著增加(53.2倍)。探針5在pH 7.4下的檢測限為5.96×10-5mol/L,在pH 4.5下的檢出限為1.87×10-5mol/L,低于pH 7.4時的檢出限。探針5中的高烯丙基氨基為甲醛的識別基團,可與甲醛反應生成亞胺中間體,該中間體進一步經過2-aza-Cope重排和水解,生成吸電子能力較強的醛基化合物。因此,在較低的pH值下探針更容易形成亞胺中間體,從而促進探針與甲醛間的作用過程。同時通過密度泛函理論計算驗證了探針與甲醛反應的機理,并且能夠在HeLa細胞上進行熒光成像,獲得了良好的比值信號。探針5不僅適用于溶液中甲醛含量的測定,而且適用于具有兩個不同發射帶的生物樣品中甲醛的測定。因此對生物環境中監測甲醛具有重要意義,所以探針5在定量測定水溶液中甲醛方面具有廣泛的應用價值。

圖9 探針6的結構及對甲醛的檢測機理Fig.9 Structure of probe 6 and detection mechanism of formaldehyde

2017年Xie和Zhu課題組等[68]報道了一種新型“Turn-on”型雙光子熒光探針6(如圖9所示),該探針以具有較大斯托克斯位移和高光穩定性的4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺染料作為雙光子結構的母核。在探針6的3位上引入強吸電子基團醛基,會降低1,8-萘二甲酰亞胺的推拉能力,從而進一步增強ICT效應。同時,這種醛可以通過反應轉化為甲醛的識別基團高烯丙基胺基。當探針6與甲醛反應后,形成亞胺中間體。隨后,發生電荷促進的[3,3]-σ重排反應,并隨后進行亞胺水解以形成最終產物醛,發出熒光。探針6在10 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.4, 0.5%體積 DMSO)中,在448 nm處具有強的紫外吸收峰,熒光發射波長為550 nm,Φ=0.469,而加入甲醛后探針6發生了藍移現象,最大吸收波長變為415 nm,最大熒光發射波長變為520 nm,Φ=0.74。探針與甲醛在濃度0～0.5 mmol/L范圍內有良好的線性關系(R2=0.994 6),其檢測限為5 μmol/L。此外,雙光子細胞成像實驗證明探針6能夠檢測HeLa細胞和斑馬魚中的甲醛分子,對細胞膜有很好的穿透性,從而使探針能夠在更多的生物醫學研究中成為一個很有前景的工具。

2017年Brewer和Chang課題組[69]等報道了一系列用于檢測生物系統中甲醛的比率型熒光探針7a，7b，7c(如圖10所示),探針7a，7b，7c以久洛尼定香豆素為熒光母核,連有高烯丙基胺基作為甲醛識別基團。檢測時,探針與甲醛的縮合引發2-aza-Cope重排,隨后水解釋放具有紅移激發波長的醛產物,從而產生比率熒光。但反應速度緩慢,探針7a的雙分子速率常數為0.017 mol/(L·s)-1,限制了其在生物系統中檢測FA的應用。為了加快探針對甲醛檢測,在探針7的高烯丙基胺基上連接偕二甲基得到探針7b,這種偕二烷基取代基能通過Thorpe-Ingold效應加速與環狀過渡態的反應,可以顯著提高aza-Cope重排的速率,探針7b的雙分子速率常數為0.12 mol/(L·s)-1,與探針7a相比,速率增加了約7倍。探針7b可用于HEK293T細胞(人胚腎細胞)的甲醛成像,采用點狀染色模式時,對亞細胞定位不均勻,這可能對其在其他細胞類型中的應用造成潛在的限制。為了使探針在不同細胞類型上表現出更均勻的染色和亞細胞定位,同時保持對甲醛的高選擇性,對探針7b的羥丙基側鏈進行修飾。鏈接一個含有乙二醇-己基氯化物的酰胺,使探針在細胞中顯示出明顯改善的染色效果,得到了探針7c。探針7c也可用于HEK293T細胞(人胚腎細胞)的甲醛成像,同時,在HEK293T細胞(人胚腎細胞)中呈現出均勻的染色模式,表明其在研究甲醛生物學方面具有更廣泛的應用。此外,探針7c還可用于檢測下細胞中內源性甲醛的濃度和代謝的變化。

2017年,Xie和Tang課題組[70]等設計了一種檢測溶酶體中甲醛分子的雙光子熒光探針8(如圖11所示),探針8通過甲醛識別基團高烯丙基胺橋將具有嗎啉的萘二甲酰亞胺亞結構與香豆素結構相結合構成的,而在探針中引入嗎啉基團有助于探針分子靶向溶酶體。探針8的激發波長為390 nm,在566 nm處表現出較弱的熒光發射,因香豆素部分的熒光被萘酰亞胺猝滅,所以顯示萘酰亞胺熒光團的特征發射峰。當探針8與甲醛反應時,探針的高烯丙基胺橋裂解,萘酰亞胺結構和香豆素結構發生解離,導致發射最大值從566藍移至506 nm,主要顯示香豆素熒光團的特征發射峰。探針加入甲醛后,在pH 4.0～6.0時表現出明顯增強的熒光,與溶酶體的生理pH范圍一致。探針在FA濃度為10～250 μmol/L范圍內呈現出極好的線性關系(R2=0.993 0),檢測限為3.0 μmol/L。此外,探針8能夠在活細胞和組織中檢測甲醛分子,并且只對溶酶體中的甲醛分子有響應,可以避免中性細胞溶質和其他細胞器中甲醛的干擾,提高了空間分辨率和準確性。總之,探針8能夠通過雙光子熒光成像成功地應用于活體細胞和動物中甲醛分子的原位可視化,為闡明與甲醛相關疾病的發病機制提供了一種有潛力的分子工具。

圖10 探針7的結構及對甲醛的檢測機理Fig.10 Structure of probe 7 and detection mechanism of formaldehyde

圖11 探針8的結構及對甲醛的檢測機理Fig.11 Structure of probe 8 and detection mechanism of formaldehyde

2017年,Singha和Ahn等[71]設計了一種雙光子比率型甲醛探針9(如圖12所示),探針9是在1-(萘-2-基)吡咯烷上連有一個仲-高烯丙胺基所構成的。在用甲醛處理后,探針將形成亞胺離子,其經歷2-aza-Cope重排后水解,誘導分子內電荷轉移(ICT),進而得到6-(吡咯烷-1-基)-2-萘甲醛,一種供體-受體型雙光子吸收染料。選擇吡咯烷基團作為染料的電子供體部分,因其與傳統的N,N二甲氨基供體相比,能在水介質中產生較強的熒光。探針9本身在438 nm處顯示出強烈的藍色發射。在加入甲醛后,探針在438 nm處的發射逐漸減少,而在533 nm處出現新峰。探針9在甲醛濃度為200～400 μmol/L范圍內的線性關系良好,檢測限為10 μmol/L,pH耐受范圍為4.0～7.4。此外,探針9可用于MCF7細胞(人乳腺癌細胞)、小鼠組織及器官中內源性甲醛分子的檢測。

圖12 探針9的結構及對甲醛的檢測機理Fig.12 Structure of probe 9 and detection mechanism of formaldehyde

2017年Li和Qian等[72]報道了第一個基于2-aza-Cope重排反應的用于檢測植物組織內源甲醛的比率型熒光探針10(如圖13所示)。探針10以N,N-二甲基喹啉-6-胺結構作為熒光母核,高烯丙基胺基為甲醛的識別基團。探針與甲醛反應后,高烯丙基胺基形成亞胺中間體,然后發生重排和水解產生醛產物,發生熒光性質變化。探針10在254 nm和353 nm處顯示出兩個紫外吸收峰,熒光發射波長為495 nm,加入甲醛后,分別在277 nm和429 nm處有兩個紫外吸收峰,在570 nm處熒光發射峰增強,在495 nm處熒光發射峰減弱,均發生了紅移。探針10的pH耐受范圍為3.0～11.0,在與甲醛濃度(0～200 μmol/L)之間存在極好的線性關系(R2=0.988 3),在水溶液中的檢測限為0.5 μmol/L。此外,探針可對擬南芥活體根尖組織的內源性甲醛進行成像。同時,探針能夠檢測實際水樣中的甲醛,并能夠用于定位擬南芥活組織中的內源性甲醛,實現對外源性甲醛和內源性甲醛的檢測。綜上,探針10為應用于其他植物甲醛分子的熒光成像,更好地了解其代謝機制及甲醛相關生理病理研究的進展提供了方法。

圖13 探針10的結構及對甲醛的檢測機理Fig.13 Structure of probe 10 and detection mechanism of formaldehyde

2017年,You和Chen等[73]設計了一種新的基于ICT的比率型熒光探針11(如圖14所示),

圖14 探針11的結構及對甲醛的檢測機理Fig.14 Structure of probe 11 and detection mechanism of formaldehyde

探針11以苯基菲并咪唑為熒光母核,高烯丙基胺基為甲醛識別基團。因高烯丙基胺基阻礙了ICT過程,探針本身無熒光。與甲醛反應后,高烯丙基胺基先形成亞胺離子,再進行2-aza-Cope重排,最終水解生成醛產物恢復ICT過程發出熒光。探針11在440 nm處呈現熒光發射,Φ=0.62。加入甲醛后,在440 nm處的發射峰降低,在520 nm處出現一個新的發射峰,Φ=0.51,熒光發射波長發生了紅移。探針11的檢測限為0.84 μmol/L。除此之外,探針11能夠對HeLa細胞的內源性甲醛進行成像和定量,還可對斑馬魚和小鼠腎組織的內源性甲醛進行成像。探針11具有量子產率高、響應快和檢測限低等優異的性能,有望成為進一步探索生物系統中甲醛生物學機制的有效工具。

2018年Zhou和Xiao課題組[74]設計了一種可在水溶液、血清和空氣中檢測甲醛的新型的基于aza-Cope反應的比率型甲醛熒光探針12(如圖15所示)。探針以2-(2-羥基苯基)苯并噻唑作為熒光母核,pro-aza-Cope重排部分高烯丙基胺基作為甲醛的反應位點。探針12在pH 7.4, 10 mmol/L PBS緩沖液(含體積分數40%CH3CN)中,在333nm處有最大紫外吸收峰,在462 nm處顯示出一個強熒光發射峰。加入不同濃度甲醛后,隨著甲醛濃度的增加,探針在333 nm處的紫外吸收峰下降,而在425 nm處的紫外吸收峰增大,并在355 nm和395 nm處分別有一個等當點。同時,探針在541 nm處(79 nm的紅移)的熒光發射峰強度逐漸增加,而在462 nm處的熒光發射峰逐漸降低。這是因甲醛將能夠通過aza-Cope重排反應將富電子的pro-aza-Cope重排部分轉化為缺電子的醛基,產生強大的分子內電荷轉移(ICT)過程導致探針的熒光帶發生紅移,并提供比率型熒光信號。在pH 7.4, 10 mmol/L PBS緩沖液(含體積分數40%CH3CN)中,探針與甲醛(0～30 mmol/L)的發射比(I541/I462)成良好的線性正比,檢測限為4.1×10-4mol/L。此外,探針12成功的應用于對小牛血清中甲醛和氣態甲醛的檢測,并且探針12在生物系統進一步的研究正在進行,為生物系統及環境中檢測甲醛提供了有力的工具。

圖15 探針12的結構及對甲醛的檢測機理Fig.15 Structure of probe 12 and detection mechanism of formaldehyde

2018年,Zhao和Yin課題組[75]等基于2-aza-Cope重排反應設計了一種可檢測氣態甲醛的“Turn-on”型熒光探針13(如圖16所示)。在已經報道過的探針中大多是由具有聚集猝滅(ACQ)特征的熒光團構成,它們在聚集狀態下發出微弱的熒光,需要在溶劑中分散,只能在溶液中檢測FA。與ACQ熒光團相比,聚集誘導發射(AIE)熒光團能夠在聚集狀態下發射出強熒光,更適合制備便攜式固體傳感器,實現對氣態甲醛的簡便、靈敏的檢測。探針13以聚集誘導發射(AIE)熒光團四苯基乙烯為熒光母核,高烯丙基胺基作為甲醛識別位點,并加入4-硝基芐基(Ph-NO2)作為熒光猝滅基團。高烯丙基胺可以通過2-aza-Cope重排與甲醛反應并釋放熒光猝滅劑以實現熒光“Turn-on”。最初,探針13由于電子供體和電子受體之間的光誘導電子轉移(PET)而具有弱熒光(固態熒光量子產率ΦFS=2.64%)。在與甲醛反應后,探針變成高發射性化合物(ΦFS=35.42%)具有較強熒光,并且在酸性(pH<5)溶液中能催化探針13與甲醛的反應。基于探針的AIE特性,作者通過在高效薄層色譜硅膠板上直接加載探針制備了便攜式固體傳感器,即甲醛測試板。甲醛測試板在504 nm處的熒光強度和氣態甲醛在濃度為0～1.6 mg/m3范圍內呈現良好的線性關系(R2=0.998 3),檢出限為0.036 mg/m3,低于世界衛生組織建議的空氣質量指標值0.1 mg/m3。甲醛測試板實現了對氣態甲醛的靈敏、選擇性和定量檢測,易于用肉眼觀察,適用于檢測室內空氣中的氣態甲醛,且具有便攜性,與基于溶液的傳感器相比,使用和運輸更加安全方便,為開發便攜式甲醛傳感器提供了新的設計思路。

圖16 探針13的結構及對甲醛的檢測機理Fig.16 Structure of probe 13 and detection mechanism of formaldehyde

圖17 探針14的結構及對甲醛的檢測機理Fig.17 Structure of probe 14 and detection mechanism of formaldehyde

2018年Yang和Lin課題組[76]等報道了一個新的基于ICT的“Turn-on”型甲醛探針14(如圖17所示)。探針14以吡咯烷基苯并口惡二唑為熒光母核,高烯丙基胺基作為甲醛反應位點,其中苯并口惡二唑是一種典型的基于分子內電荷轉移(ICT)的熒光染料。由于高烯丙基胺基的吸電子能力較差,探針最初沒有熒光。然而,與甲醛反應后,高烯丙基胺基將通過縮合反應生成亞胺中間體,亞胺中間體進一步發生2-aza-Cope重排和水解,最終生成醛類衍生物,是一種具有高效ICT性能的強熒光物質。當向探針溶液中加入80當量的甲醛時,熒光強度達到了最大值,熒光強度提高了265.5倍(量子產率從0.003 2顯著提高到0.061 5)。探針在563 nm處的發射強度值與0～100 μmol/L和200～500 μmol/L范圍內的甲醛濃度成線性關系,表明探針14能夠廣泛定量測定水溶液中甲醛的濃度范圍。探針對于甲醛低濃度和高濃度水平,檢測限分別為4.35×10-8mol/L和4.97×10-8mol/L。此外,探針14可用于HeLa細胞中甲醛分子的生物成像。探針14不僅適用于檢測水溶液和活細胞中的甲醛,同時,為甲醛的檢測和設計高信噪比熒光甲醛探針提供一個新的工具和新的思路。

2 基于取代基NHNH2與甲醛反應的探針

2015年Liu和Li等[77]設計一種基于PET的甲醛熒光探針15(如圖18所示),以8-羥基喹啉與苯并噻唑共軛構成了熒光探針15,以NHNH2作為甲醛的識別基團,通過甲醛與肼的肼酰化反應生成甲肼。探針15在水溶液中顯示出微弱的熒光,加入甲醛后,在467 nm處的熒光增強5.5倍。探針與甲醛可在0～1.3×10-4mol/L的濃度范圍內呈現良好的線性關系,并能夠對其進行定量檢測,檢測限低至900 nmol/L。探針15還可用于檢測魚片、魷魚絲、魚腐竹、干海草等幾種商品食品中的甲醛殘留量。

圖18 探針15的結構及對甲醛的檢測機理Fig.18 Structure of probe 15 and detection mechanism of formaldehyde

圖19 探針16的結構及對甲醛的檢測機理Fig.19 Structure of probe 16 and detection mechanism of formaldehyde

2016年Liu和Sun課題組[78]等報道了一個以1,8-萘二甲酰亞胺為母體的甲醛熒光探針 16(如圖19所示)。探針利用NHNH2作為反應位點,能在溫和條件下快速檢測甲醛。探針16與甲醛之間發生了加成縮合反應,位于1,8-萘二甲酰亞胺單元4位的亞胺基和氨基使化合物形成推拉體系,該體系在受到激發后可進行ICT過程,而叔胺基的質子化阻礙了PET過程,從而抑制了1,8-萘二甲酰亞胺的熒光,使探針與甲醛反應的產物具有良好的熒光性質。當激發波長為410 nm時,探針16在515 nm處顯示弱熒光,加入甲醛后,室溫下9min內熒光強度明顯增強,且隨著甲醛濃度的增加,在515 nm處熒光逐漸增強。探針的熒光強度與0～200 μmol/L范圍內的甲醛濃度成良好的線性關系(R=0.995 9),最低檢測限為0.104 μmol/L。此外,為了驗證探針16 在甲醛檢測中的實用價值,建立了一套熒光試紙系統,在添加試劑后制備的試紙外觀與白色濾紙基本相同。當加入乙腈(體積分數10%乙酸)或甲醛水溶液后,在自然光下,試紙的顏色幾乎沒有明顯的變化,而在365 nm紫外光照射下,這些試紙顯示出明顯的綠色熒光。因此,熒光試紙有望用于甲醛的定性檢測,為構建用于定量檢測甲醛的熒光探針提供了可能。

2016年,Tang和Lin課題組[79]設計了一種基于光誘導電子轉移(PET)的雙光子熒光探針17(如圖20所示),探針以經典的雙光子染料骨架1,8-萘二甲酰亞胺為母體,以NHNH2作為反應位點與甲醛發生縮合反應,實現快速檢測甲醛的目的。探針17在PBS緩沖溶液(10 mmol/L,pH=7.4,含體積分數1%的二甲亞砜)中幾乎不發熒光,加入甲醛后,在543 nm處形成一個強的熒光發射峰,熒光增強了325倍的,檢出限為7.1×10-7mol/L。探針17與甲醛分子的反應速率為0.39 min-1。探針17對甲醛有較高的選擇性,可在Hela細胞中進行生物成像。此外,探針可以成像肝組織中的甲醛,首次實現監測活體組織中的內源性甲醛。因此,探針17有望成為研究甲醛在活體組織中生理和病理作用的強有力的分子工具。

圖20 探針17的結構及對甲醛的檢測機理Fig.20 Structure of probe 17 and detection mechanism of formaldehyde

2017年Wu和Xu等[80]設計了一種基于N-氨基蒽-1,9-二羧基酰亞胺用于檢測甲醛的新型熒光探針18(如圖21所示)。探針18以NHNH2作為甲醛的識別基團,能與甲醛發生醛亞胺縮合反應,生成的產物具有較好的熒光性質。由于從肼到蒽酰亞胺結構的光誘導電子轉移(PET),在含有體積分數40%DMF(10 mmol/L,pH 7.4)的PBS溶液中,探針18在518 nm處有弱的熒光發射峰(Φ=0.015)。隨著甲醛的加入,PET過程受到了抑制,在518 nm處的熒光強度逐漸增大(Φ=0.041),并在3 min內迅速達到最大值。探針18在518 nm處的熒光強度與0～13 mmol/l范圍內的甲醛濃度呈線性關系,R2=0.991 4,檢出限為988 nmol/L。探針18在加入甲醛后,熒光強度在pH 3.5～5.0之間顯著增加,說明在弱酸性條件下,有利于甲醛與探針的胺基之間的醛亞胺縮合反應。探針具有較低的細胞毒性。此外,探針18能在在HeLa細胞中的外源性甲醛進行了生物成像,沒有加入甲醛時,HeLa細胞不發光,甲醛處理后,細胞輪廓清晰,發出熒光綠色。綜上,探針18可以快速定量檢測出濃度范圍廣、檢測限低的甲醛,在復雜的生物系統中具有潛在的應用前景。

圖21 探針18的結構及對甲醛的檢測機理Fig.21 Structure of probe 18 and detection mechanism of formaldehyde

2017年Liang和Li等[81]報道了一種用于超快速檢測生物樣品中甲醛,基于香豆素-肼基的熒光探針19(如圖22所示)。探針19是基于香豆素骨架,通過7-(二乙基氨基)香豆素的C-2位將肼基引入來設計的,由于氧原子上的孤對電子與CN的超共軛,探針中的肼具有強的親核性,易于與甲醛反應形成亞胺鍵,而由于香豆素電子體系中電子極化程度的改變,進而改變探針19的熒光性質。在磷酸鹽緩沖溶液(PBS,10 mmol/L,pH 7.4)中,探針19在364 nm處有最大紫外吸收峰(Φ=0.003),而加入甲醛后,導致紫外吸收峰發生紅移為393 nm(Φ=0.029)。探針本身幾乎是無熒光的,與甲醛反應后,在1 min內能夠與甲醛完全反應,熒光發射峰為500 nm,并隨著甲醛濃度的增加而顯著增強,檢出限為0.4 μmol/L。探針19對甲醛的選擇性超過了其他潛在競爭的生物羰基物種,且有68倍的熒光增強。此外,探針19通過對神經血管細胞和生物組織中甲醛分子的進行了生物成像,實現監測神經血管細胞和小鼠腦組織內源性甲醛的動態變化。這表明探針19能夠快速、特異地檢測生物體內的內源性甲醛,具有良好的時空敏感性和空間分辨率,并且有助于闡明神經血管疾病病理過程及神經退行性病變的病理進展中所涉及的機制,具有作為診斷工具的潛力。

圖22 探針19的結構及對甲醛的檢測機理Fig.22 Structure of probe 19 and detection mechanism of formaldehyde

2018年Bi和Zeng課題組[82]設計了一種新型的基于PET機理,以1,8-萘二甲酰亞胺為母體的甲醛熒光探針20(如圖23所示)。基于光誘導電子轉移(PET)過程,探針20在水溶液中具有微弱的熒光,與甲醛反應后,探針的PET過程受到抑制,在525 nm處的熒光顯著增強,可以在6 min內實現對甲醛的檢測。探針20在525 nm處的熒光強度與0～30 μmol/L范圍內的甲醛濃度呈現出極好的線性關系,檢測限為20 nmol/L,實現了對水溶液中的甲醛定量檢測。作者還研制了一種能夠加載探針20的甲醛檢測試紙,試紙在水溶液中呈現微弱的藍色熒光,隨著甲醛的加入,在紫外光燈365 nm處,能夠觀察到明顯的熒光增強,為甲醛的檢測提供了一種方便、靈敏、快速的方法。此外,探針20還用于對SMMC-7721細胞(人肝癌細胞)的進行了生物成像,這表明探針能夠檢測活細胞中的甲醛。因此,推測這種熒光探針可能為環境和生物系統中甲醛的檢測提供一種有前景的檢測工具。

圖23 探針20的結構及對甲醛的檢測機理Fig.23 Structure of probe 20 and detection mechanism of formaldehyde

2018年Li和Lu等[83]報道了一種用于甲醛檢測的親水性的肼基-萘二甲酰亞胺官能化的殼聚糖(HN-殼聚糖)聚合物探針21(如圖24所示)。與其小分子類似物相比,HN-殼聚糖是以生物高分子殼聚糖的隨機螺旋聚合物鏈為基礎的,因此能夠利用多個肼基-萘二甲酰亞胺識別位點和相鄰羥基的協同作用,通過弱的超分子相互作用來富集聚合物鏈周圍的低濃度的甲醛污染物,加速了探針上的肼基與甲醛的反應,實現熒光信號的放大和快速響應。另外,探針21的水溶性功能也避免了在檢測實驗中使用有毒和揮發性有機溶劑。在水溶液中探針21利用多個識別位點和相鄰羥基的協同效應,到達平衡反應的時間小于1 min,具有高度敏感性。與小分子類似物相比,聚合物探針21的平衡響應時間顯著縮短。在365nm探針21在水溶液幾乎是無熒光的,因為萘酰亞胺基存在鄰近的肼基,可以通過PET過程,對萘二甲酰亞胺的熒光起到強熒光猝滅劑的作用。然而,當加入微量(百萬分之一)的甲醛后,熒光增強,因從肼基到萘酰亞胺熒光團的PET過程會被甲醛與肼基之間的快速化學反應抑制,表現出強的熒光發射。聚合物探針21在酸性條件(pH=1.0～6.5)下對堿性條件的熒光響應更佳,有較寬的pH范圍,探針21的理論檢出限約為0.05×10-6(1.66 μmol/L)。由于聚合物探針21具有較高的靈敏度、選擇性、快的響應速度、寬的線性檢測范圍和光穩定性,可用于復雜的水樣和食品樣品中甲醛的檢測。基于聚合物探針21的設計原理,可廣泛應用于構建其他功能強大的聚合物探針,用于其他重要污染物的超快檢測。

圖24 探針21的結構及對甲醛的檢測機理Fig.24 Structure of probe 21 and detection mechanism of formaldehyde

3 基于取代基NH2與甲醛反應的探針

圖25 探針22的結構及對甲醛的檢測機理Fig.25 Structure of probe 22 and detection mechanism of formaldehyde

2017年Song和Lü等[84]設計了一種可逆熒光探針22(如圖25所示),用于活體細胞和體內甲醛的檢測。探針22以具有高熒光量子產率,良好的光穩定性,優異的摩爾消光系數和良好的pH穩定性的二氟化硼-二吡咯甲烷(BODIPY)熒光染料作為熒光基團,伯氨基作為響應基團。在探針中伯氨基不影響BODIPY熒光團的光誘導的電子轉移過程(PET),在與FA發生醛亞胺縮合反應后,將產生亞胺(CN)基團,而CN異構化和旋轉可猝滅探針的熒光發射。探針22在pH 7.4,10 mmol/L HEPES的緩沖液,最大紫外吸收波長為495 nm(Φ=0.85),熒光發射波長為515 nm。加入FA后,探針在515 nm處熒光強度逐漸降低,熒光量子產率降低至Φ=0.01。探針22對0～500 μmol/L的甲醛范圍內,存在良好的線性關系,線性擬合常數r=0.999 1,檢出限為50 nmol/L,探針22對甲醛的檢測具有高靈敏度。探針22的可逆循環可以重復至少3次,且熒光衰減較小。此外,探針22可對SMMC-7721細胞(人肝癌細胞)、小鼠的器官和組織進行生物成像,不僅可以定位于細胞質中并跟蹤活細胞中外源性和內源性甲醛濃度的波動,對活細胞中甲醛的可逆檢測;而且成功應用于定性評估體外解剖器官中的甲醛濃度。上述應用使探針22成為研究甲醛在細胞和體內生理和病理功能的潛在化學工具。

2018年Cao和Qin等[85]基于二氟化硼-二吡咯甲烷(BODIPY)染料合成了一種新型的甲醛高選擇性熒光探針23(如圖26所示)。探針23以硼-二吡咯亞甲基染料作為熒光團,鄰苯二胺(OPDA)作為反應基團。氨基取代或N-取代的BODIPY染料總是具有低熒光量子產率,這是由于分子內電荷轉移(ICT)過程在激發態下從鄰苯二胺的氮原子到BODIPY的有效猝滅。當氨基與醛的反應抑制了BODIPY受體的ICT過程,熒光減弱。探針23在乙腈/HEPES緩沖液(20mmol/L,pH7.4)中的紫外吸收峰為482 nm,熒光發射波長為525 nm。加入FA后,在482 nm處的吸收峰呈下降趨勢,在525 nm出現新的吸收峰,熒光發射峰發生紅移(525～548 nm)。探針23的熒光強度在0～1 000 μmol/L的甲醛濃度范圍內呈線性增加,最低檢測限為0.104 μmol/L。此外,探針23能夠監測HeLa細胞中自發生成的甲醛。同時開發了一種試紙檢測氣體中的甲醛,表明探針對內源細胞和氣體環境中的甲醛具有較高的響應性。

圖26 探針23的結構及對甲醛的檢測機理Fig.26 Structure of probe 23 and detection mechanism of formaldehyde

4 基于其他反應的測定甲醛探針

2011年Li和Han課題組[86]報道了一種基于羅丹明B衍生物的甲醛熒光探針24(如圖27所示),探針24以羅丹明B為母體,乙二胺為甲醛的反應基團,加入甲醛后,乙二胺與甲醛反應形成席夫堿中間體1,其促進分子內脫氧內酰胺開環,形成含有咪唑烷的羅丹明B產物,發出熒光。探針熒光發射峰在590 nm處,且熒光發射強度隨甲醛濃度的增加而增強。探針24對烷基醛和芳香族醛具有良好的選擇性。除此之外,鑒于羅丹明的特殊熒光性質,如高熒光量子產率、生物正交熒光光譜和高光穩定性,探針24對細胞表面醛類化合物的化學選擇性和熒光性標記表明,含有脫氧內酯的羅丹明在活細胞表面唾液蛋白的可視化或跟蹤方面具有潛在的應用價值,如用于儀器或肉眼檢測甲醛,甲醛釋放抗癌藥物的評價和某些癌癥內源性甲醛的定量測定。

圖27 探針24的結構及對甲醛的檢測機理Fig.27 Structure of probe 24 and detection mechanism of formaldehyde

2016年He和Lin課題組[87]設計合成了一種超快速甲醛熒光探針25(如圖28所示),探針以乙二胺基團作為甲醛反應位點,羅丹明6G作為熒光團。探針本身是無熒光的,當乙二胺基與甲醛之間縮合形成亞氨基中間體,其隨后使分子內脫氧內酰胺開環,并產生咪唑產物,熒光恢復。探針25在水溶液(pH 7.4,含體積分數50%N,N-二甲基甲酰胺的25 mmol/L PBS緩沖液)中幾乎是非熒光的(ΦF=0.21),隨著甲醛劑量的增加,在560 nm處熒光發射強度逐漸增加(7.4倍),并與甲醛濃度存在良好的線性關系,檢出限為7.7×10-7mol/L,能夠對水溶液中低濃度甲醛進行定量檢測。并且,當用2.0當量濃度的甲醛處理探針時,其發射強度在約10s內迅速達到最大值,可以超快速監控甲醛。此外,探針25能夠檢測Hela細胞中的外源性甲醛,成功地應用于香菇干中甲醛的定量檢測,并首次實現了肉眼快速檢測室內的甲醛氣體。這表明探針25在監測生活系統、食品工業和環境中的甲醛具有廣闊的應用前景。探針25在室內能夠甲醛檢測氣體的最低濃度為0.044mol/m3。探針25在體內外對甲醛均表現出明顯的熒光增強反應,有望成為檢測生物系統、食品工業和環境中低水平甲醛的實用工具。

圖28 探針25的結構及對甲醛的檢測機理Fig.28 Structure of probe 25 and detection mechanism of formaldehyde

2017年Liu和Zeng課題組[88]等報道了一種基于鄰-二氨基羅丹明衍生物的甲醛熒光探針26(如圖29所示),用于從其他醛類化合物中鑒別和檢測甲醛(FA)、甲基乙二醛(MGO)和乙二醛(GD)。探針26在642 nm處表現出微弱的熒光發射,加入甲醛后,探針出現輕微藍移,在620 nm處的熒光增強,量子產率從0.07增加到0.55,檢出限為8.3 μmol/L。而甲基乙二醛的加入引起明顯的熒光減弱,量子產率從0.07下降到0.014。同時,乙二醛的也使探針從642 nm藍移到620 nm,熒光強度無明顯變化,表明探針26具有良好的選擇性,可以通過不同的特征光譜響應區分甲醛、甲基乙二醛、乙二醛和其他醛類化合物。此外,探針26可用于L929細胞(成纖維細胞)中甲醛和甲基乙二醛的生物成像。探針具有細胞滲透性,可以作為一種工具,分別通過熒光開關模式監測活細胞中的甲醛、甲基乙二醛和乙二醛。

2018年Xie和Zhu課題組[89]設計了第一個具有能夠檢測pH和甲醛的“turn-off”型熒光探針27(如圖30所示)。高烯丙基胺基被認為是有效的甲醛識別基團,氮原子質子化是一個好的pH觸發器,這使得高烯丙基胺基也可以作為檢測pH的敏感官能團。探針以4-羥基1,8-萘二甲酰亞胺為母體,高烯丙基氨基為識別集團,與甲醛反應會導致自發的β-消除反應,釋放出4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺,發出綠色熒光,在酸性條件下發出藍色熒光。探針27在pH=3.5時在365 nm處有紫外吸收峰,當pH值增加到7.4時吸光度逐漸下降。探針27在pH 7.4下幾乎沒有熒光,在酸性pH 4.0下455 nm處發射強度的顯著增強,熒光強度增加10倍。探針27在PBS緩沖液(體積分數0.5%二甲亞砜,10 mmol/L, pH 7.4)經甲醛處理后,在555 nm處的發射強度顯著增強,與0～0.25 mmol/L范圍內的甲醛濃度有良好的線性關系,R2=0.99,檢出限為10 μmol/L。探針27的檢測速率常數確定為0.01 min-1。此外,探針27同時應用于HeLa細胞中的酸性溶酶體和外源性及內源性甲醛的生物成像。探針27在活細胞中的檢出限為37 μmol/L。用單一熒光探針同時成像復雜生物體內的pH和甲醛,為進一步理解pH和甲醛間的相互作用和細胞間的相互作用提供技術支撐。因此,探針27在雙分析物檢測領域是一種很有前途的分析工具。

圖29 探針26的結構及對甲醛的檢測機理Fig.29 Structure of probe 26 and detection mechanism of formaldehyde

圖30 探針27的結構及對甲醛的檢測機理Fig.30 Structure of probe 27 and detection mechanism of formaldehyde

2018年Xu和Lou等[90]報道了兩種甲醛再生熒光探針28a和28b(如圖31所示)。探針28以3-(芐基氨基)琥珀酰亞胺作為甲醛的選擇性反應基團,實現了前所未有的區域特異性FA誘導的分子內反應策略。探針28能夠捕獲甲醛分子,誘導區域特異性酰亞胺鍵裂解,然后通過獨特的雙PeT/ICT猝滅機制釋放捕獲的甲醛分子,同時產生熒光信號。通過甲醇胺中間體8的分子內酰胺酯交換反應加速了甲醛誘導的α氨基酰胺6的酰胺鍵的水解。探針28a在pH 7.4和5.0下對甲醛都有熒光啟動響應,在pH 7.4下,熒光強度在前10 min內增加70.4倍后,在3 h內降至30.7倍的穩定水平。當pH值為5.0時,熒光強度在2 h內最大增加45.6倍,并保持不變,檢出限為0.48 μmol/L。探針28b中未質子化的嗎啉基團的PET效應有助于抑制胞質或其他中性細胞器中探針對甲醛的響應,從而增強酶體中對甲醛選擇性。在pH為5.0的高甲醛濃度下,探針28b的熒光強度高達51.8倍,沒有明顯的熒光減弱,檢出極限為0.145 μmol/L,pH適應范圍為4.0～6.0,特別適合溶酶體內部的甲醛檢測(pH 4.5～5.5)。此外,探針28a可以通過熒光成像檢測HeLa細胞中的外源性甲醛,探針28b能夠選擇性檢測溶酶體內的甲醛。并且，這兩種探針的聯合使用可以檢測溶酶體和細胞質中甲醛的相對水平。這些探針在細胞內和溶酶體內激活甲醛水平的檢測和成像方面顯示出了潛力,并以其獨特的甲醛再生特性為研究生物系統中甲醛的穩態、信號和功能提供了有用的工具。此外,新的分析物誘導的分子內結構策略可以作為設計新的熒光探針的一種方法。

圖31 探針28的結構及對甲醛的檢測機理Fig.31 Structure of probe 28 and detection mechanism of formaldehyde

5 總結與展望

活性羰基物種是生物體內重要的活性物質之一,其在體內發生異常時會引起許多疾病,而甲醛作為一種重要的活性羰基物種,在生命活動中也具有重要意義。設計合成一種能夠動態實時監測甲醛的熒光探針是當前的研究熱點,實現分子水平、細胞水平和活體水平的成像分析,有利于了解甲醛在生理學病理學的功能作用,有助于了解甲醛的來源和去路,以此發現甲醛代謝平衡的新機制,同時,將理論與現實生活相聯系,有助于預防甲醛引起的危害。本文根據不同識別基團與甲醛的反應將其分類,總結歸納了近幾年來報道的甲醛熒光探針,發現單光子熒光探針較多,雙光子熒光探針較少,測定甲醛的相應時間有待提高。所以,未來設計監測甲醛的熒光探針,可以在提高靈敏性和選擇性的基礎上,定性以及定量檢測甲醛,實現快速實時動態可視化檢測甲醛濃度,著重突出研究甲醛與其他分子以及蛋白質的相互作用,揭示其背后的生物規律以及其于疾病的相關性等方面,同時,運用高水平的科技聯用技術,例如近紅外熒光以及多光子成像技術,三維成像和高時空分辨單分子成像技術,多方位,多空間,多信息更好的實現以上目標。