測定ClO-的水溶性熒光探針的合成及應用

杜俊莉,李小露,任 帆,吳少平

(西北大學 生命科學學院/糖生物學及藥物化學國際聯(lián)合實驗室,陜西 西安 710069)

香豆素 (coumarin) 類化合物是廣泛存在于自然界的天然雜環(huán)化合物,其基本骨架為苯并α-吡喃酮 (如圖1)。其具有很多獨特的藥理活性,比如:抗病毒[1]、抗菌[2]、抗血管硬化[3]以及抗癌[4-5]等,是最早發(fā)現(xiàn)具有熒光性質的物質之一。香豆素母核結構本身不呈現(xiàn)熒光特性,但經適當結構修飾后的香豆素衍生物,產生強的熒光特性[6-8]。香豆素衍生物具有熒光量子產率高、Stokes位移大、光穩(wěn)定性好、細胞毒性小、對生物組織的損害小等優(yōu)點[9],因此,以香豆素類化合物為母體的熒光探針的合成及其相關應用成為近年來一個新興的研究熱點。

圖1 香豆素類熒光化合物結構Fig.1 Structure of coumarin fluorescent compounds

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是一類存在于生物體內典型的氧的單電子還原產物[10],一般是對機體內或天然環(huán)境中由氧組成,含氧且性質活潑的物質的總稱。次氯酸(HClO)/次氯酸鹽(ClO-)是眾多活性氧(ROS)中最重要的一種[11],它是由活性有機體中的髓過氧化物酶(MPO)催化過氧化氫和氯離子產生的。過量可導致組織損傷,引發(fā)多種疾病,如:關節(jié)炎、腎臟疾病、肺損傷、心血管疾病及癌癥等[12-19]。但是，由于其反應活性強、存在壽命短等特點,對它的檢測仍然是目前的研究熱點。因此,我們在前期研究的基礎上[20-21],利用香豆素熒光探針的優(yōu)點,在香豆素類化合物上引入對甲氧基苯酚識別基團,設計合成了一個新穎的熒光探針HMAT。在探針HMAT中,香豆素熒光團與受體單元對甲氧基苯酚之間存在PET效應,對熒光有強的淬滅作用;但當受體與客體結合,即對甲氧基苯酚被ClO-氧化成醌式結構以后,PET效應受到抑制,香豆素熒光團就會發(fā)射熒光。實驗結果證明,探針HMAT具有水溶性好、靈敏度高、抗干擾強、響應速度快、線性關系良好、檢出限低等優(yōu)點。同時,探針HMAT具有細胞毒性低、細胞膜透過性良好和生物相容性好的特性,在神經母瘤細胞SH-SY5Y中取得了良好的熒光成像效果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(F-7000,日立高新技術公司),紫外可見分光(UV-2550,日本島津),超導核磁共振儀 (6001541ASP,VARIAN公司),電離飛行質譜儀(MALDI-TOFMass Spectrometer),激光共聚焦顯微鏡(OlympusFV-1000,日本Olympus公司),三用紫外分析儀(ZF-C型,上海康禾光電儀器有限公司),電子天平(BSA124S,賽多利斯科學儀器有限公司)。

乙酰乙酸乙酯(141-97-9,國藥集團化學試劑),哌啶(110-89-4,麥克林試劑),2-羥基-5-甲氧基苯甲醛(672-13-9,麥克林試劑)。

1.2 探針HMAT的合成

以8-羥基四氫吡啶并喹啉-9-甲醛為原料,和乙酰乙酸乙酯,哌啶在乙醇中回流5 h,合成香豆素類化合物2,以化合物2為骨架,通過與2-羥基-5-甲氧基苯甲醛在甲苯中回流72 h,連接識別基團來得到探針HMAT，如圖2所示，用來檢測ClO-。

圖2 探針HMAT的合成Fig.2 Probe HMAT

1.2.1 化合物2的合成 稱取化合物1 (200.0 mg) 置于25 mL圓底燒瓶中,加入10 mL無水EtOH,隨后將乙酰乙酸乙酯 (174 μL),哌啶 (200 μL)加入圓底燒瓶中,混合液在85℃回流5 h,蒸干溶劑,殘渣用V(PE)∶V(EtOAc)=4∶1作為洗脫液硅膠柱層析得到純化合物2 (收率:93%,Rf=0.12,V(PE)∶V(EtOAc)=4∶1)。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 8.31 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 3.33 (dd,J=11.6, 6.2 Hz, 4H), 2.86 (t,J=6.2 Hz, 2H), 2.74 (d,J=5.9 Hz, 2H), 2.65 (s, 3H), 1.96 (d,J=5.2 Hz, 4H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3)δ: 195.97, 161.25, 153.75, 148.75, 147.89, 127.76, 119.53, 114.81, 108.03, 105.59, 50.33, 49.93, 30.79, 27.41, 21.11, 20.64, 20.10。

1.2.2 探針HMAT的合成 稱取化合物2 (100 mg), 2-羥基-5-甲氧基苯甲醛 (80.6 mg)置于25 mL圓底燒瓶中, 加入10 mL無水甲苯, 后加入100 μL哌啶, 反應混合物在110 ℃回流72 h。 反應結束后, 沉淀過濾, 用V(DCM)∶V(MeOH)=30∶1作為洗脫液硅膠柱層析得到純探針HMAT (收率:31%,Rf=0.28,v(DCM)∶v(MeOH)=20∶1。HRMS (C25H23NO5): calcd. for [M+H]+418.165 4; found: [M+H]+418.164 1。

1.3 實驗樣品的制備

探針HMAT標準溶液 (1.0 mmol/L)的配制:準確稱取10.4 mg探針HMAT于25 mL容量瓶中,用DMF定容至刻度線,備用。

ClO-標準溶液 (1.0 mmol/L)的配制:準確量取84.5 μL 4%(質量分數(shù))NaClO溶液于50 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度線,備用。

PBS緩沖液 (0.1mol/L, pH 7.4)的配制:準確稱取0.270 0 g磷酸二氫鉀 (KH2PO4),1.420 0 g磷酸氫二鈉 (Na2HPO4),8.000 0 g氯化鈉 (NaCl),0.200 0 g氯化鉀 (KCl),混合后加超純水約800 mL充分攪拌溶解,調pH到7.4,定容到1 L,備用。

2 結果與討論

2.1 探針HMAT與ClO-反應的光譜特性

首先,我們研究了探針HMAT與不同濃度ClO-反應的紫外吸收光譜變化 (圖3)。可以看出,探針本身在450 nm處有強的紫外吸收,隨著ClO-濃度的增加 (0～20 μmol/L),體系的紫外吸收強度逐漸降低,后逐漸達到平衡狀態(tài)。體系的吸收強度在0～6 μmol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關系(R2=0.986 2)。

圖3 探針HMAT與不同濃度ClO-反應的吸收光譜及工作曲線Fig.3 Working curve and UV-vis spectra of probe HMAT (10 μmol/L) upon the addition of 0～20 μmol/L ClO-

其次,研究了探針HMAT與ClO-反應的熒光光譜(圖4)。可以看出,探針HMAT本身有弱的熒光信號(λex=450 nm,λem=500 nm),當加入ClO-以后,探針在490 nm處的熒光信號顯著增強(λex=440 nm),其熒光強度增加13倍。

圖4 探針HMAT與ClO-反應的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of probe HMAT reaction with ClO-

最后,研究了探針HMAT與不同濃度ClO-反應的熒光光譜變化,如圖5所示,探針本身在500 nm處有微弱的熒光信號,當ClO-的濃度 (0～9 μmol/L) 逐漸增大的時候,探針的發(fā)射波長發(fā)生藍移,在490 nm處的熒光強度顯著增加。隨后,當ClO-濃度增加的時候,體系的熒光強度達到平衡狀態(tài)。體系的熒光響應與ClO-濃度在1.0～9.0 μmol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關系(R2=0.993 2),最低檢出限為1.3 nmol/L。

2.2 動力學研究

因為生物體內活性氧反應活性強、存在壽命短,因此發(fā)現(xiàn)一種可以實時、動態(tài)、快速監(jiān)測活性氧變化的方法是非常重要的。為此,我們檢測了探針HMAT對ClO-的響應的動力學情況 (圖6a),在沒有加入ClO-時,探針HMAT呈現(xiàn)弱熒光信號,而且熒光信號不隨時間改變而改變,而加入20 μmol/L ClO-后,發(fā)現(xiàn)490 nm處的熒光強度迅速顯著增強, 隨后基本不隨時間的變化而變化。這表明探針HMAT具有對ClO-響應速度快(瞬時響應)、靈敏度高的優(yōu)點。

生理狀態(tài)下,正常組織細胞外pH值介于7.2～7.4之間,但是,惡性腫瘤組織細胞外pH值介于6.5～6.9之間。因此,我們要評估探針HMAT在不同pH范圍內對響應程度,看它能否應用于惡性腫瘤組織中。在pH 3.0～14.0的范圍內,研究了探針和加入ClO-后的熒光信號的變化 (圖6b),在未加入ClO-時,探針HMAT在pH 3.0～14.0范圍內熒光信號未發(fā)生明顯變化。這說明探針本身在pH 3.0～14.0范圍內穩(wěn)定。當加入ClO-后,體系的熒光強度在pH 3.0～14.0范圍內也基本沒有發(fā)生變化。以上結果表明,探針HMAT本身以及與ClO-反應后都對pH變化具有廣泛的耐受性。

圖5 探針HMAT與不同濃度ClO-反應的熒光光譜及工作曲線Fig.5 Working arve and Fluorescence spectra of probe HMAT (10 μmol/L) upon the addition of 0～20 μmol/L ClO-

2.3 選擇性研究

為了研究探針HMAT與ClO-之間的選擇性,實驗測定了探針HMAT與一些生物活性相關的物質,如活性氧(ROS)、活性硫(RSS)、活性氮(RNS)、陰離子和陽離子等相互作用的熒光光譜 (圖7a)。只有在加入ClO-后,體系在490 nm處的熒光信號顯著增強。隨后,我們又檢測了探針HMAT對其他分析物的抗干擾能力(圖7b)。可以看出,其他分析物都不會干擾ClO-的檢測。這些結果表明探針HMAT對ClO-的測定具有很好的選擇性,不受其他干擾物質的影響,使其能夠在復雜的生物系統(tǒng)中專一的檢測ClO-,并且可以裸眼觀測。

2.4 反應機理探討

在探針HMAT中,香豆素熒光團與識別基團對甲氧基苯酚之間存在PET效應,對熒光有強的淬滅作用。但是，當受體與客體結合,即對甲氧基苯酚被ClO-氧化成醌式結構以后,PET效應受到抑制,香豆素熒光團就會發(fā)射熒光，如圖8所示。

2.5 生物應用研究

在光學研究的基礎上,我們又對探針HMAT的生物應用進行了研究。探針HMAT對SH-SY5Y細胞的細胞毒性結果表明(圖9),當探針濃度高達25 μmol/L時,SH-SY5Y細胞的存活率依然可以達到80%以上,說明探針對SH-SY5Y細胞幾乎沒有毒性。

圖6 探針HMAT與CLO-反應的時間及pH影響Fig.6 Working pH and Time-response of HMAT with ClO-

圖7 探針HMAT對ClO-的選擇性和競爭性Fig.7 The selectivity and compctition of fluorescence spectra of HMOT

圖8 探針HMAT與ClO-的反應機理Fig.8 Reaction mechanism of probe HMAT with ClO-

圖9 探針HMAT的細胞毒性分析實驗Fig.9 Cytotoxicity assays of probe HMAT at different concentrations for SH-SY5Y neuroblastoma cells

在細胞毒性實驗結果的基礎上,對探針HMAT (10 μmol/L) 進行了SH-SY5Y細胞成像實驗，如圖10所示。可以看出，探針本身在綠色通道 (430～490 nm) 下有微弱的熒光信號,當加入20 μmol/L ClO-后,細胞產生強烈的熒光信號。上述結果證明,探針HMAT具有在活細胞中可視化檢測ClO-的能力。

圖10 探針HMAT在SH-SY5Y細胞中熒光成像實驗Fig.10 Fluorescence image of SH-SY5Y neuroblastoma cells incubated with probe HMAT

3 結 論

本文成功設計合成了一種基于香豆素骨架的熒光探針HMAT,在加入ClO-之前,探針在500 nm處有微弱的熒光信號,但加入ClO-后,探針在490 nm處的熒光信號顯著增強,反應體系的熒光強度與ClO-濃度在1.0～9.0 μmol/L內呈現(xiàn)良好的線性關系。實驗結果表明,探針HMAT具有選擇性好、靈敏度高、抗干擾強、響應速度快、線性關系良好、檢出限低等優(yōu)點。此外,探針HMAT具有水溶性好、細胞毒性低、細胞膜透過性良好和生物相容性好的特性。細胞成像實驗表明,探針HMAT可以有效實現(xiàn)活細胞內ClO-的實時、動態(tài)、可視監(jiān)測,為生命體中ClO-的快速檢測提供了技術支撐,亦可為疾病的早期診斷與治療提供一定的參考價值。