測定生物體內Cu2+的熒光探針構建及應用研究

李小露,楊麗麗,任 帆,吳少平

(1.西北大學 生命科學學院/糖生物學及藥物化學國際聯合實驗室, 陜西 西安 710069)

重金屬離子含量過多或過少都會對生物體產生較大的影響,而重金屬銅在生物體內的許多生理過程中起著尤為重要的作用。人體內保持最佳的銅離子水平對平衡新陳代謝和保持人體健康至關重要。另外,由于金屬銅被廣泛的應用工業生產中,作為一種重要的環境污染物,工業廢銅的排放也會對環境造成了很大的污染和危害[1-4]。

阿爾茨海默病 (Alzheimer′s disease, AD) 又稱老年癡呆癥,是一種原發性神經退行性腦病。目前普遍認為金屬離子與AD有著密切的關系。金屬離子諸如Cu2+一方面可以誘導β-淀粉樣蛋白 (Αβ) 發生聚集,形成淀粉斑導致癡呆;另一方面具有氧化還原活性的金屬離子如Cu2+與Αβ相互作用,可能會產生活性氧 (ROS) 而引起氧化應激,造成神經元功能喪失,最終導致AD的發生[5-8]。因此,設計高靈敏度、高選擇性、原位檢測銅離子的方法在生命科學中具有重要意義。

近年來,熒光檢測技術在生命科學和環境化學領域發揮著不可替代的作用[9-11],因此,開發一種可靠,靈敏的探針,可用于有效監測銅生物系統的濃度波動是一項有吸引力和緊迫的任務。傳統檢測痕量銅的方法有電感耦合等離子體原子發射光譜(ICP),伏安法和原子吸收光譜法可等[12-16]。然而,這些方法存在一些缺點,包括復雜的樣品處理過程和昂貴設備的需求,不能用于生理環境中銅的實時檢測和監測。熒光探針由于其選擇性,靈敏性,非破壞性和實時監測質量而被認為是最有力的工具[17]。

本論文設計了以羅丹明B為骨架,在羅丹明B骨架上引入噻吩雜環來合成新型的用來特異性的測定Cu2+的熒光探針。該探針上的噻吩雜環與Cu2+絡合導致羅丹明B開環,在540 nm處出現一個強的發射峰,表現出強的熒光信號,從而在V(CH3CN)∶V(HEPES)=1∶1(pH=7.4) 緩沖溶液中實現了對銅離子的高靈敏高選擇性熒光檢測,對探針熒光性質進行了研究,探針在1～10 μmol/L范圍內呈良好的線性關系,最低檢測限為0.32 μmol/L。另外,由于該探針具有高選擇性、高靈敏性和低毒性的特點,可以對生物體內的Cu2+進行實時監控。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(F-7000,日立高新技術公司),紫外可見分光(UV-2550,日本島津)日本島津,超導核磁共振儀 (6001541ASP,VARIAN公司),電離飛行質譜儀(MALDI-TOFMass Spectrometer),激光共聚焦顯微鏡(OlympusFV-1000,日本Olympus公司),旋轉蒸發儀(RE-2000A,上海亞榮生化儀器廠),循環水式多用真空泵(SHZSHZ-D(III,鄭州科豐儀器設備有限公司),三用紫外分析儀(ZF-C型,上海康禾光電儀器有限公司)電子天平(BSA124S,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。

1.2 探針BOTC及其參比的合成

1.2.1 化合物RBH (2a) 的合成 將羅丹明B(4.780 0 g)溶解在乙醇溶液(50 mL)中,在30分鐘內緩慢滴加水合肼溶液(8 mL)。然后將反應混合物在85℃ 回流4h,直至溶液的熒光消失。反應溶液在室溫下冷卻并用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取,有機相用無水Na2SO4干燥,過濾,旋干,粗產物通過硅膠柱V(DCM)∶V(EtOH)=40∶1純化得到RBH (2a)。Rf:0.61(V(DCM)∶V(EtOH)=20∶1)。收率:95.7 %。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ7.94 (s, 2H), 7.52 (dd,J=11.4, 5.7 Hz, 1H), 7.49～7.44 (m, 2H), 7.33 (d,J=3.3 Hz, 1H), 7.14 (d,J=7.0 Hz, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.66 (s, 2H), 6.35 (s, 2H), 6.27 (s, 2H), 3.32 (dd,J=14.3, 7.0 Hz, 8H), 1.15 (t,J=7.0 Hz, 12H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3)δ176.07, 163.80, 161.51, 158.82, 142.46, 139.98, 138.03, 133.78, 132.92, 117.98, 114.52,107.93, 87.31, 87.10,

圖1 探針BOTC及其參比的合成Fig.1 Schemel the synthesis of probe and reference

86.89,75.86, 54.33, 22.58。

1.2.2 探針BOTC (3a) 的合成 RBH(200.0 mg),NaH(52.8 mg),DMAP(26.8 mg)溶于無水乙腈(10 mL)中,然后加入2-噻吩甲酰氯(141 μL),回流2 h。反應結束后,過濾,將紅色溶液旋干,殘渣用DCM稀釋并萃取(3×30mL),有機層用無水Na2SO4干燥,過濾,旋干,粗產物通過硅膠柱V(PE)∶V(EtOAc)=4∶1純化得到探針BOTC (3a)。Rf:0.44V(PE)∶V(EtOAc)=1∶1。收率:64.6%。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ7.94 (s, 2H), 7.52 (dd,J=11.4, 5.7 Hz, 1H), 7.49-7.44 (m, 2H), 7.33 (d,J=3.3 Hz, 1H), 7.14 (d,J=7.0 Hz, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.66 (s, 2H), 6.35 (s, 2H), 6.27 (s, 2H), 3.32 (dd,J=14.3, 7.0 Hz, 8H), 1.15 (t,J=7.0 Hz, 12H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3)δ153.87, 149.04, 130.82, 129.50, 129.35, 128.27, 123.70, 108.06, 104.35, 97.84, 44.42, 12.74。HRMS (C33H34N4O3S): calcd. for [M+H]+567.2430; found: [M+H]+567.2432。

1.2.3 化合物2b的合成 將羅丹明B(2.500 0 g)溶解在乙醇(50 mL)中,加入乙二胺(6.7 mL),混合物在85 ℃下回流20 h。旋干溶劑得到粗品,用CH3CN重結晶得到化合物2b。Rf:0.47V(DCM)∶V(MeOH)=10∶1。產率:87.3%。

1.2.4 對照化合物3b的合成 化合物2b(100.0 mg),NaH(25.2 mg),DMAP(13.4 mg)溶于無水乙腈(5 mL)中,然后將2-噻吩甲酰氯(67.4 μL)加入該混合溶液中,回流2 h。反應結束后,過濾,將紅色濾液真空濃縮,殘渣用DCM稀釋并萃取(3×30 mL),有機層用無水Na2SO4干燥,過濾,旋干,粗產物通過硅膠柱(洗脫液:V(DCM)∶V(MeOH)=40∶1)分離純化得到對照化合物3b。Rf:0.78V(DCM)∶V(MeOH)=20∶1。收率:79.0 %。HRMS (C35H38N4O3S): calcd. for [M+H]+595.274 3; found: [M+H]+595.275 3。

1.3 實驗樣品的制備

探針BOTC標準溶液(1.0 mmol/L)的制備:準確稱取探針BOTC 14.2 mg,用無水乙醇溶解并定容到25 mL容量瓶中,即得,將其存放在4℃冰箱中備用。

對照3b標準溶液(1.0 mmol/L)的制備:準確稱取對照化合物3b 14.9 mg,用無水乙醇溶解并定容到25 mL容量瓶中,即得,將其存放在4℃冰箱中備用。

HEPES緩沖溶液(0.1 mol/L, pH 7.4)的制備:準確稱取4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.380 0 g,將其溶于80 mL蒸餾水中,用20%(質量分數)的NaOH調節pH至7.4,然后用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中,即得。

Cu2+溶液的制備:準確稱取Cu(NO3)2H2O 18.8 mg, 用V(EtOH)∶V(H2O)=1∶1溶解定容到100 mL容量瓶中,即得,將其存放在4℃冰箱中備用。

1.4 熒光光譜的測定

在比色管中加入50 μL探針BOTC(1.0 mmol/L),1 mL CH3CN,1.5 mL的Hepes緩沖溶液(0.1 mol/L,pH=7.4)以及不同濃度的待測離子溶液(100 μL),用蒸餾水將反應體系定容至5 mL后掃描該體系的熒光光譜及紫外吸收光譜。

1.5 細胞毒性試驗

CCK-8法檢測探針BOTC對SH-SY5Y 細胞的細胞毒性。在96孔板中加入100 μL的細胞懸液(每孔約1×105個細胞),將培養板放在培養箱預培養24 h(37℃,體積分數5%CO2),加入10 μL不同濃度(0，5，10，15，20和25 μmol/L)的探針BOTC溶液,接著在培養箱孵育24 h后向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡,以免影響OD值的讀數)。將培養板在培養箱內孵育1～4 h。用酶標儀測定540 nm處的吸光度。

1.6 細胞成像實驗

在直徑20 mm的共聚焦專用皿中加入 1 mL的細胞懸液,在培養箱中預培養24 h(37 ℃,體積分數5%CO2)。加入10 μmol/L的探針BOTC孵育10 min,加入20 μmol/L Cu2+溶液共孵育10 min,然后用PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌3次,用質量分數4%的多聚甲醛溶液固定,最后在共聚焦顯微鏡下成像。

2 結果與討論

2.1 探針BOTC的光譜性質

首先,我們測定了探針BOTC與Cu2+反應的熒光光譜和吸收光譜(圖2),游離的探針是無色的,當加入Cu2+后,日光燈下呈紅色,紫外燈下可以看到產生橙色熒光(圖3)。

圖2 探針BOTC與Cu2+反應的吸收和熒光光譜Fig.2 UV-vis absorption (a) and emission spectra (b) of probe BOTC in the absence and presence of Cu2+

圖3 探針BOTC顏色變化Fig.3 Image of color change of probe after the addition of different metal ions

研究了不同濃度的Cu2+對探針BOTC吸收光譜的影響(圖4)。可以看出,探針本身在555 nm處有強的紫外吸收,隨著Cu2+濃度的增加(1～40 μmol/L),體系的紫外吸收強度逐漸降低,然后慢慢趨于穩定,體系的吸收強度在1～16 μmol/L的范圍內成良好的線性關系,R2=0.995 3,檢出限為0.32 μmol/L。接下來又研究了不同濃度的Cu2+對探針BOTC熒光光譜的影響(圖5),在激發波長為540 nm下,探針本身在580 nm處沒有熒光響應,當加入不同濃度的Cu2+(1～40 μmol/L)之后,隨著Cu2+濃度的增加熒光響應逐漸增強并慢慢趨于穩定。體系的熒光響應與Cu2+濃度在1～10 μmol/L范圍內成良好的線性關系,R2=0.997 2。

2.2 動力學研究

為了確定探針BOTC與Cu2+之間的反應速率,我們研究了該反應的動力學情況(圖6)。可以觀察到,游離探針的熒光信號隨著時間的變化幾乎保持不變,當加入Cu2+后,反應體系熒光信號迅速增強,隨后熒光強度逐漸趨于平穩,結果表明了探針BOTC和Cu2+的反應十分迅速,響應時間小于1 min。

為了研究HEPES緩沖pH值的不同對探針BOTC以及加入Cu2+后的影響,我們檢測了在pH 3～14的范圍內體系熒光強度的變化(圖6)。可以發現,探針本身的熒光強度隨著緩沖液pH值的變化幾乎保持不變,當向其中加入Cu2+后,在pH 3～8的范圍內熒光強度逐漸增加,而在pH 9～14的范圍內逐漸降低,最后我們取與生物體生理環境pH相近的pH 7.4作為后續工作測量的標準。由檢測結果可以得知探針對pH的耐受范圍廣泛,可以滿足生物體內測定的要求。

圖4 探針BOTC與不同濃度Cu2+反應的吸收光譜及工作曲線Fig.4 Absorption spectra of probe upon the addition of Cu2+

圖5 探針BOTC與不同濃度Cu2+反應的熒光光譜及工作曲線Fig.5 Fluorescence emission spectra of probe upon the addition of Cu2+

圖6 探針BOTC與Cu2+反應的動力學曲線及pH影響Fig.6 Working pH and Time-dependent of BoOTC with Cu2+

2.3 選擇性研究

為了研究探針BOTC對Cu2+的選擇性能,我們檢測了探針與其他生物活性物質的熒光響應情況(圖7)和吸收(圖8)。當向探針BOTC溶液中分別加入其他的活性待測離子后,體系的熒光信號并沒有明顯的變化,和探針自身的熒光信號強度幾乎一致,而當向探針BOTC溶液中加入后Cu2+,體系的熒光信號明顯增強。上述實驗現象表明探針BOTC對Cu2+有獨特的選擇性,并且表現出很強的抗干擾能力。

圖7 探針BOTC對Cu2+選擇性的熒光光譜Fig.7 The selectirlty of fluorescence spectra of BOTC

圖8 探針BOTC對Cu2+選擇性的吸收光譜Fig.8 The selectivity of UV-vis spectra of BOTC

2.4 反應機理探討

以羅丹明B為起始原料,經過兩步反應合成了探針BOTC(圖1)。探針本身無熒光,當向探針體系中加入Cu2+后,Cu2+會和探針分子中的噻吩雜環絡合,生成了相應的絡合產物,改變了探針分子原有的結構,導致羅丹明分子開環,產生強烈的熒光，如圖9所示。而參比化合物因為氮氮鍵之間有兩個亞甲基,分子空間距離較大,與Cu2+不能絡合,所以不會產生熒光。

圖9 探針反應機理Fig.9 The reaction mechanism of BOTC

2.5 生物應用

為了將探針BOTC應用于活細胞熒光成像中,采用CCK-8法實驗來測定探針BOTC對細胞的毒性水平(圖10)。將不同濃度的探針BOTC分別加入到神經母瘤SH-SY5Y細胞溶液中,在37℃條件下培養24 h后,用酶標儀檢測細胞的存活數量,研究發現,當探針BOTC濃度高達25 μmol/L時,SH-SY5Y細胞的存活率依然很高,這說明探針對SH-SY5Y細胞表現出低的細胞毒性。

圖10 探針BOTC的細胞毒性分析實驗Fig.10 Cytotoxicity assay for SH-SY5Y cells treated with probe BOTC

在細胞毒性實驗結果的基礎上,我們選擇了探針BOTC濃度為10 μmol/L進行了SH-SY5Y細胞成像實驗研究(圖11)。可以看出,探針本身在細胞中沒有熒光,當加入20 μmol/L Cu2+,孵育5 min后,在540 nm處有強烈的熒光增強,這說明探針BOTC對SH-SY5Y細胞有很好的成像效果。

圖11 探針BOTC在SH-Y5YS細胞中熒光成像分析實驗Fig.11 Confocal fluorescence microscopic images of SH-SY5Y cells

3 結 論

將羅丹明B與水合肼在乙醇中合成羅丹明B酰肼,后加入2-噻吩甲酰氯,通過簡單的兩步反應合成探針分子BOTC,在緩沖液V(CH3CN)∶V(HEPES)=1∶1, pH=7.4中,檢測其熒光性質。實驗結果表明,只有加入Cu2+時,在540 nm處產生出現一個強的發射峰,表現出強的熒光信號,探針分子BOTC由無色變為紅色,探針的熒光強度在Cu2+濃度為0～10 μmol/L范圍內呈現良好的線性關系(R2=0.997 2),最低檢測線為 0.32 μmol/L。該探針BOTC具有細胞毒性低,反應時間快,選擇性好,靈敏度高,檢出限低的特點,并且在SH-Y5YS細胞內有良好的熒光成像效果。該方法為生物體內的Cu2+的檢測提供了新的思路。