熱療聯合旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白對小細胞肺癌H446增殖的影響*

吳合亮 潘靖丹 李美辰 杜晶晶 陰皓鋒 安子熙 杜孌英

承德醫學院，河北省承德市 067000

肺癌是一種對人類健康和生命威脅很大的惡性腫瘤，在我國肺癌發病率和死亡率呈上升趨勢[1]。目前肺癌已位居惡性腫瘤發病率和死亡率之首，尋找一種作用靶點多而副作用少的藥物至關重要。旋毛蟲(Trichinella spiralis,T.spiralis)肌幼蟲(Muscle-larva, ML)排泄分泌蛋白(Excretory-secretory proteins,ESPs)是從旋毛蟲肌幼蟲培養液中提取的一種生物活性物質。已有研究表明，旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白體外作用于某些腫瘤細胞能使其生長受到抑制，并能誘導腫瘤細胞發生凋亡[2]。腫瘤熱療(Hyperthermia,HT)主要是通過紅外線、高頻電磁波、熱水浴、超聲波等致熱源，將腫瘤局部或全身加熱到有效治療溫度并維持一段時間，以達到既可殺滅腫瘤細胞，又可不損害正常組織細胞的一種治療方法，在腫瘤的綜合治療中發揮著重要的作用[3]。本研究以人小細胞肺癌H446細胞作為研究對象，觀察了熱療聯合旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白對H446細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 旋毛蟲、實驗動物和細胞株 實驗所用旋毛蟲為豬源旋毛蟲，由本教研室保種。實驗動物為清潔型健康成年昆明小鼠，體重18～32g，購自承德醫學院動物實驗中心。人小細胞肺癌H446細胞株購自上海北諾生物科技有限公司。

1.2 實驗試劑 MTT，二甲基亞砜(DMSO)，BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海索萊寶生物科技有限責任公司；RPMI1640培養基，胎牛血清，胰蛋白酶消化液(0.25%)購自美國Gibco公司；氯化鈉購自天津市百世化工有限責任公司。

1.3 旋毛蟲肌幼蟲的收集和排泄分泌蛋白的制備 參照文獻4的方法，提取旋毛蟲肌幼蟲，經過純水多次洗滌沉淀后，用4%的明膠作為佐劑，對旋毛蟲進行計數，調整蟲體密度約為3 000條/ml,每只小鼠經口灌服0.1ml含旋毛蟲肌幼蟲的明膠，保蟲35d后，采用頸椎離斷法處死，去其四肢、內臟、脂肪等。取其肌肉，先用純水多次洗滌，用干凈的剪刀剪成小塊狀，再置于粉碎機內攪碎，加入1.5%的胃蛋白酶和1.5%的鹽酸，于37℃恒溫水浴鍋中消化3～4h后，加入0.9%NaCl終止消化，100目無菌銅網過濾沉淀45min，去掉肉液，用生理鹽水多次洗滌，獲取旋毛蟲肌幼蟲。將純凈的旋毛蟲肌幼蟲移入含青鏈霉素的無血清培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱培養24h，選擇無污染、死蟲率<5%的培養皿收集上清液(旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白)，4℃、12 000g離心30min，0.22μm濾膜過濾除菌后分裝，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量，-80℃保存。

1.4 H446細胞的培養與傳代 在液氮中取出裝有H446細胞的凍存管，置于37℃恒溫水浴鍋中快速完全消融，避免結晶傷害細胞。解凍后將凍存管置于離心機中離心，在超凈臺中小心棄掉凍存液。往凍存管中加入0.5ml RPMI1640培養基(含10%血清和1%青鏈霉素混合液)，重新懸浮細胞，吹打混勻后移入60mm培養皿，補加2.5ml培養基，放入37℃、5%CO2培養箱中繼續培養。待細胞長到培養皿的90%～95%，進行細胞傳代，3次傳代后取對數生長期的H446細胞待用。

1.5 實驗分組及給藥 實驗分為對照組、熱處理組、ESPs處理組、熱處理聯合ESPs組。對照組：H446細胞培養過程中不作任何處理；熱處理組：將細胞消化后放置離心管中在42℃水浴中加熱2h；ESPs處理組：將提取的旋毛蟲肌幼蟲ESPs用無血清培養基稀釋成0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.6mg/ml，分別與H446細胞共培養；熱處理聯合ESPs組：先經水浴處理后加入各濃度的ESPs。

1.6 MTT法檢測H446細胞增殖抑制率 按1.5分組處理細胞，取對數生長期的H446細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，以6×103個/孔，接種于96孔培養板，每孔100μl，每組各設5個復孔，于37℃、5%CO2培養箱中培養24h后，吸棄上清。ESPs組、熱處理聯合ESPs組每孔加入200μl ESPs。對照組、熱處理組每孔加入200μl不含ESPs的RPMI1640培養基，培養24h、48h后，每孔補加20μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續培養4h后吸棄上清，每孔加入150μl DMSO，振板10min,通過酶標儀測定吸光度OD值，計算不同處理方法對細胞的抑制率。抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.7 統計學方法 應用SPSS19.0進行統計學分析,數據用均數±標準差表示,數據間的比較采用ONEWAY-ANOVA，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

結果顯示，熱處理組、ESPs處理組、熱處理聯合ESPs處理組均對H446細胞有明顯的抑制作用，呈現出劑量—時間依賴性效應(圖1、圖2)。H446細胞在ESPs單獨作用下，隨著藥物濃度的逐漸增大，時間的延長，抑制率也在增大，與對照組比較差異有統計學意義(P<0．05)。熱處理聯合ESPs處理能抑制小細胞肺癌H446細胞增殖，并且隨著藥物濃度的逐漸增大，時間的延長，抑制率也增大，與對照組比較差異有統計學意義(P<0．05)。熱療聯合ESPs處理組對H446細胞的抑制作用最強，與同時間同濃度ESPs處理組相比差異有統計學意義(P<0．05)，與同時間熱處理組相比差異具有統計學意義(P<0．05)。見表1、表2。

圖1 ESPs對H446細胞的抑制率

圖2 熱療聯合ESPs對H446細胞的抑制率

ESPs濃度(mg/ml)24h48h 0.1512.72±1.07?16.25±0.95? 0.3017.11±0.59?20.25±1.45? 0.6020.98±1.39?28.09±3.17?

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

根據國家癌癥中心發布的《2018中國腫瘤登記年報》顯示，由于人口老齡化和新的不健康生活方式的出現，世界范圍內的癌癥負擔正在迅速上升。

表2 熱療聯合旋毛蟲ESPs對H446細胞抑制率

注：與對照組比較，*P<0.05。

癌癥是導致人死亡的主要原因之一，并在中國造成了沉重的疾病負擔。其中肺癌位居惡性腫瘤發病率和死亡率第一位，且人數呈遞增趨勢[5]。因此如何安全、有效治療肺癌在醫學界受到廣泛關注。

近年來腫瘤生物制劑的發現成為了研究熱點。李慧萍等[6]成功構建了原核表達載體pET-28a(+)-A200711，A200711蛋白以包涵體形式在大腸桿菌中進行了高效表達。經SDS-PAGE及Westernblot分析確定蛋白為旋毛蟲抗腫瘤基因A200711表達產物。將A200711蛋白作用于H7402細胞，發現隨著濃度的增大，增殖抑制率也在增大，增殖抑制率與濃度之間存在量效關系，同時隨作用時間的延長增殖抑制率也明顯增加。陳文輝等[7]發現感染不同階段旋毛蟲的小鼠血清及幼蟲抗原均可抑制乳腺癌MCF-7細胞活力，誘導其發生凋亡。羅婧梅等[8-9]研究發現旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白(ESPs)存在抑制腫瘤的成分，并且能夠發揮抑制小細胞肺癌H446增殖和誘導H446細胞凋亡的作用。

腫瘤熱療，即應用熱能治療腫瘤的一種方法，是繼手術、放療、化療、生物等療法之外的又一種重要的腫瘤治療方法。熱療抗腫瘤的機制主要包括對腫瘤細胞膜和腫瘤細胞骨架的影響、對腫瘤血管的影響、引起腫瘤細胞的凋亡、提高自身免疫力等[10]。Kalamida等[11]研究發現，不同溫度進行順鉑治療肺腺癌H1299細胞的過程中，40℃熱療聯合化療治療組與常溫化療組相比，H1299細胞存活率、增殖指數均明顯下降，其中細胞存活率可減少2/3，同時研究發現熱療化療聯合治療組的細胞內半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9含量上升，熱休克蛋白90含量下降。Wang等[12]的一項針對82例晚期非小細胞肺癌患者的隨機對照試驗研究發現，采用射頻熱療聯合GP方案(吉西他濱聯合順鉑)治療4周期的熱療化療聯合治療組患者的臨床獲益率達90.70%，較單純GP方案(71.79%)明顯提高，同時兩組患者化療相關不良反應發生率差異無統計學意義。

本研究發現42℃加熱2h聯合旋毛蟲肌幼蟲ESPs可以抑制H446細胞增殖，與對照組比差異有統計學意義(P<0．05)。熱療聯合ESPs處理組對H446細胞的抑制作用最強，組間比較差異有統計學意義(P<0．05)。H446細胞在ESPs單獨作用下，隨著藥物濃度的增大，抑制率也在逐漸增大，濃度為0.15mg/ml、0.30mg/ml、0.60mg/ml的排泄分泌蛋白于48h抑制率分別達16.25%、20.25%、28.09%，單獨熱處理組，抑制率達49.50%。42℃加熱2h聯合旋毛蟲肌幼蟲ESPs，濃度為0.15mg/ml、0.30mg/ml、0.60mg/ml分別達49.98%、55.52%、57.46%，與同濃度單獨使用比較差異有統計學意義(P<0．05)，說明42℃加熱可增加細胞對ESPs的敏感性，為進一步研究提供了一定依據。