HRP標記的二抗檢測heme結合蛋白造成假陽性問題的探討

張亞男　張春曉　陳曉波

摘要：為了驗證對辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）作為二抗標記物在檢測heme結合蛋白時產生假陽性問題的推測，以菠菜細胞色素b6f復合體（Cyt b6f）和鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶（FNR）為檢測對象（前者含有heme結合蛋白Cyt f，后者不含heme基團），采用菠菜FNR一抗、HRP和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）標記的二抗，設計對比實驗。結果表明，在使用HRP標記的二抗體系中，Cyt f不經一抗和二抗孵育即可顯色，這是明顯的假陽性;而在ALP標記的二抗體系中，Cyt f條帶不顯色，只有FNR條帶顯色。在western blot實驗中，如果被檢測蛋白為heme結合蛋白或者混有少量heme結合蛋白，應避免采用HRP標記的二抗，建議使用ALP標記的二抗或者其他二抗產品;heme結合蛋白具有類似HRP的氧化還原酶活性，其本身可以和顯色液反應，從而產生假陽性，干擾對實驗結果的判斷。

關鍵詞：植物生物化學;蛋白免疫印跡雜交;辣根過氧化物酶;heme結合蛋白;假陽性

中圖分類號：Q503;Q554+.6文獻標志碼：A

ZHANG Yanan，ZHANG Chunxiao，CHEN Xiaobo.Study on the false positive problem caused by HRP-labeled secondary antibody in detecting heme binding protein[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2019，40（3）：273-278.Study on the false positive problem caused by HRP-labeled secondary

antibody in detecting heme binding protein

ZHANG Yanan， ZHANG Chunxiao， CHEN Xiaobo

（School of Bioscience and Boiengineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang，Hebei 050018， China）

Abstract：In order to study the false positive problem during detecting heme binding protein with horseradish peroxidase （HRP） as secondary antibody， spinach cytochrome b6f complex （Cyt b6f） and ferredoxin-NADP+ oxidoreductase （FNR） are used as the test material （the former contains the heme binding protein Cyt f， and the latter does not contain heme group）. A comparative experiment is designed through the use of the primary antibody of spinach FNR and secondary antibodies labeled with HRP and alkaline phosphatase （ALP）. The results indicate that in the HRP-labeled secondary antibody system， Cyt f could be colored even without the incubation by the primary antibody and the secondary antibody， which is a significant false positive. In the ALP-labeled secondary antibody system， the Cyt f doesn't show color， and only the FNR is colored. In western blot experiments， if the protein to be detected is a heme-binding protein or contains a small amount of heme-binding protein， HRP-labeled secondary antibodies should be avoided and ALP-labeled secondary antibodies or other secondary antibodies should be recommended. It is speculated that the heme-binding protein has an HRP-like oxidoreductase activity， namely it can react with the color developing solution， thereby generating a false positive and interfering with the judgment of the experimental results.

Keywords：plant biochemistry; western blot; horseradish peroxidase; heme binding protein; false positive

蛋白質印跡或免疫印跡（western blot， WB）技術是利用抗原抗體雜交原理定性或定量檢測蛋白質的一種手段[1-2]。實驗室常用的WB操作流程是通過SDS-PAGE將樣品蛋白質分離，再將其轉移到固相載體上，一般多采用PVDF膜、尼龍膜或NC膜作為固相載體，然后把固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與其對應的第一抗體（一抗）發生免疫雜交反應，特異性一抗再與和靈敏檢測系統相偶聯的第二抗體（二抗）反應，最終檢測到能夠和一抗特異結合的目的蛋白[3]。WB技術擁有電泳高分辨率和酶免疫測定的高敏感性及特異性，在分子生物學、生物化學、免疫遺傳學等研究領域得到了非常廣泛的應用[4-5]。

WB檢測蛋白的高敏感性和特異性除了和特異性抗體有關外，還和用于檢測的二級抗體的標記物有關。一般來講，偶聯到二抗上的標記物（有時也叫探針）有酶（主要包括辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）或其衍生物（APAAP，PAP））、熒光基團（FITC，Rhodamine，Texas Red，PE，Rhodamine，Dylight等）、生物素、金顆粒等[6]。不同WB類型實驗需要使用不同的二抗標記物，但就一般實驗室來講，酶（主要是HRP和ALP）標記的二抗的使用最為廣泛，因為相對于其他標記方式，酶標記的二抗成本低廉，操作簡單方便，對檢測設備要求也低[3]。HRP的顯色原理是利用其過氧化物酶的活性，催化反應需要底物過氧化氫（H2O2）和供氫體（DH2）。實驗中常用的供氫體有DAB（3，3二氨基聯苯胺）、魯米諾（luminol，5-氨基-2，3-二氫-1，4-酞嗪二）等。這些物質大多數是沒有顏色的還原性染料，可以被氧化成有顏色的氧化型的染料（D）或者通過發光來檢測活性[7-8]。ALP的顯色機理則是利用其水解酶的活性，當ALP處于pH值為9.4的堿性環境時，在鎂離子激活下，β-甘油磷酸鈉水解得到磷酸，磷酸與高濃度的鈣鹽結合形成無色的磷酸鈣，再進一步與硝酸鈷發生反應形成磷酸鈷，最后經硫化胺處理形成黑色的硫化鈷沉淀在酶活性的位置[9]。HRP和ALP對于二抗的敏感度相同，但由于HRP成本更低，并且產生的顏色比較明顯，方便觀察分析，因而HRP標記的二抗更受科研人員的青睞。

河北科技大學學報2019年第3期張亞男，等：HRP標記的二抗檢測heme結合蛋白造成假陽性問題的探討WB實驗雖然已經非常成熟了，但由于其步驟較多、涉及試劑的種類令人眼花繚亂，而檢測的蛋白又各種各樣，因而研究者在實驗中經常會因遇到這樣或那樣的問題而苦惱。多數科研人員進行此項實驗時要么參考某篇文獻，要么沿用本實驗室固有的方法，基本上是拿來就用，出了問題再找原因，對實驗細節考慮不周，如二抗試劑與被檢測蛋白之間的匹配問題。本研究使用鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶（FNR）的一抗、HRP標記的二抗，檢測細胞色素b6f（Cyt b6f）中是否含有FNR時，發現在與Cyt b6f的亞基Cyt f（一種heme結合蛋白）幾乎完全重合的位置上出現了顯著的陽性條帶，懷疑此條帶是假陽性。為了排除疑慮，以Cyt b6f和FNR為待檢樣品，使用HRP和ALP標記的2種二抗，設計了對比實驗，最終的實驗結果證實了猜測，并解釋了HRP標記的二抗檢測heme結合蛋白產生假陽性的原因。目前鮮有專門針對此方面的報道，相信本研究結果會給遇到類似問題的相關人員提供有益的參考和借鑒。

1材料和方法

1.1蛋白樣品的制備

菠菜類囊體膜制備參考文獻＼[10＼]，Cyt b6f粗樣品提取參照文獻＼[11—13＼]。此樣品混有少量的FNR，經過一次分子篩或蔗糖密度梯度離心進一步純化，可去除FNR，得到純的Cyt b6f。在Cyt b6f粗樣品的基礎上制備FNR樣品。基本步驟如下：將-20 ℃的純丙酮800 μL加入至200 μL Cyt b6f粗制品（蛋白質量濃度約為20 mg/mL）中，混勻后于冰上靜置5 min，8 000g離心5 min，去除上清液，將沉淀用-20 ℃的純丙酮再次懸浮處理，離心得到的沉淀懸浮于1 mL TS（50 mmol/L Tris， pH值為7.5，50 mmol/L NaCl）緩沖液中，9 000g 離心5 min，去掉不溶物，收集上清液，轉移到10 kD超濾管中，于5 000g離心濃縮至100 μL，即為FNR粗制品。

1.2WB實驗步驟

SDS-PAGE的制備參照文獻＼[14＼]，略作修改。分離膠濃度為15%（質量分數，下同），濃縮膠濃度為4%，將蛋白樣品加入到等體積的溶液（50 mmol/L Tris-HCl， pH值為8.0，4 mol/L尿素，2% SDS，5%乙醇，2.5%巰基乙醇）中，于90 ℃處理2 min，然后上樣。Western blot完整流程參照文獻＼[15＼]（半干式），略有修改，基本步驟如下：將凝膠玻璃板從電泳槽中取下，切去不用的部分，剪裁成和凝膠尺寸一樣大小的PVDF固相膜，放入電轉移液（240 mL H2O，60 mL 甲醇，0.5 g H3BO3，1.8 mL 10% SDS）中浸泡;剪裁12張比凝膠尺寸略大的濾紙，放入轉移緩沖液中泡透;按陰極→濾紙（6張）→凝膠→轉移膜→濾紙（6張）→陽極的順序放置在轉膜儀上，趕壓氣泡;接通電源，選擇恒壓（CV）模式，11 V，50～60 min，電流為70～90 mA。轉膜結束，可用0.1%的麗春紅檢測轉膜效果，然后用TBST（Tris-Buffered Saline Tween-20，配置方法為將8 g NaCl和2.42 g的Tris base加入800 mL水中溶解，再加入500～1 000 μL的Tween-20，用HCl調節pH值至7.4，加水定容至1 L）溶液洗至無色。然后用TBST配置的5%脫脂奶粉封閉液于搖床上封閉1 h，封閉完畢，用TBST洗膜2次，5 min/次。1∶4 000 TBST稀釋的一抗溶液，孵育 1 h，TBST洗膜2次，5 min/次; TBST稀釋5 000倍的二抗溶液，孵育1 h，TBST洗2次，5 min/次，然后加入顯色液進行顯色。

1.3TMBZ/H2O2染色鑒定Cyt f過氧化物酶活性

TMBZ/H2O2染色鑒定過氧化物酶活性的方法參照文獻＼[16＼]。染色液配制如下：將3份新配制的TMBZ甲醇溶液（6.3 mmol/L）和7份乙酸鈉溶液 （0.25 mmol/L，pH值為5.0） 混合。將WB顯色后的雜交膜浸沒在染色液中，于25 ℃黑暗溫育1 h后，加入H2O2到染色液中，使H2O2的最終濃度達到30 mmol/L。大約3 min后，結合heme的Cyt f的藍色條帶就會顯現。

1.4主要試劑

菠菜FNR一抗，購自荷蘭Agrisera公司，從兔血清中制備;HRP和ALP標記的二抗（羊抗兔），購自圣克魯斯（上海）生物技術公司（Santa Cruz）。

2實驗結果與討論

2.1實驗結果

Cyt b6f是植物葉綠體類囊體膜上一個重要的膜蛋白復合物，介于光系統1和光系統2之間，參與光合作用電子傳遞鏈的組成。一般認為，Cyt b6f由4個大亞基和4個小亞基組成，其中大亞基Cyt f 結合一個c-型的heme基團[17]。圖1 a）是提取的Cyt b6f粗制品的SDS-PAGE圖譜，分子質量從大到小依次為Cyt f，Cyt b6，Reisk[Fe-S]蛋白和亞基Ⅳ，對應的相對分子質量分別為33，23，20和17 kD，與文獻報道一致[12，15，18]。Cyt f上面的一條淺帶是FNR，相對分子質量約為35 kD[15，19]。Cyt b6f粗制品經過分子篩或蔗糖密度梯度離心之后，殘留的FNR完全被去除，得到進一步純化的Cyt b6f樣品（見圖1 b）中的3和4）。圖1Cyt b6f和FNR粗制品的SDS-PAGE電泳圖譜

Fig.1SDS-PAGE of Cyt b6f and crude FNR preparations from spinach chloroplasts

以Cyt b6f粗制品為基礎，進行2次丙酮沉淀，可以有效去除Cyt b6和亞基4等蛋白亞基，經過超濾濃縮，使FNR進行適當的純化和濃縮，得到FNR的粗制品（見圖1 b）中的5和6）。

采用菠菜FNR的一抗、HRP標記的二抗，以類囊體膜、不同濃度的FNR樣品和Cyt b6f樣品為檢測對象，結果如圖2所示。FNR粗制品中，被鑒定出FNR（記作FNR-1），Cyt b6f純制品中也被鑒定出FNR（記作FNR-2），但是這一位置與Cyt f條帶幾乎重合。因為這2個樣品都是從類囊體膜中制備的，所以理論上類囊體膜中應該顯示FNR-1和FNR-2兩條帶，但是結果類囊體膜中只顯示一條FNR條帶，并且這一條帶的位置對應于FNR-1的位置，與粗制品中FNR的位置一致。當然，也可能是類囊體膜中FNR-2含量少于FNR-1，所以導致類囊體膜中的FNR-2沒有被檢測出來。再者，隨著FNR粗樣品上樣濃度的增加（見圖2中的1—4），與Cyt f位置重合的FNR-2條帶也逐漸顯現。依據圖1 b）的電泳圖譜可知，FNR樣品中FNR和Cyt f濃度相當，一般情況下，這2條帶亮度也應該相當?？傊鲜鼋Y果使人懷疑FNR-2條帶可能是假陽性。有文獻報道，heme結合蛋白具有和HRP相似的過氧化物酶的活性[18-19]。在本實驗條件下FNR-2顯色的條帶，不能排除是Cyt f直接和顯色液反應的結果。

為了驗證上述想法，在對Cyt b6f進行蛋白雜交實驗時，設置了2個條件：一是不加一抗，二是同時不加一抗和二抗，研究在上述條件下，是否依然能夠檢測出FNR條帶。實驗結果表明，不加一抗，甚至一抗和二抗都不加，FNR-2位置的條帶都可以顯色，并且隨上樣濃度的增加顯色顯著增加。顯然，FNR-2這一條帶是假陽性，根據HRP顯色的機理，產生這一假陽性的原因是經過電泳、轉膜之后，Cyt f仍然具有一定的過氧化物酶活性，自身可以直接和顯色液反應。實驗結果如圖3所示。

改用ALP標記的二抗檢測類囊體膜、FNR粗制品和Cyt b6f純制品，見圖4。實驗結果顯示，對照條件下（即孵育一抗和二抗條件），類囊體膜和FNR粗制品中都檢測到了FNR-1，而在Cyt b6f純樣品中不僅沒有檢測到FNR-1，也沒有檢測到FNR-2（見圖4 b）中的Ⅰ），而在沒有孵育一抗和同時不孵育一抗和二抗的條件下，類囊體膜、FNR粗制品均檢測不出FNR，當然Cyt b6f樣品中也檢測不出FNR（見圖4 b）中的Ⅱ和Ⅲ），這一結果和預期完全相符。最后，在雜交顯色之后的膜上，用TMBZ/H2O2染色法檢測了Cyt f的過氧化物酶活性，該方法也是利用Cyt f的氧化還原特性把無色的TMBZ氧化成了藍色物質，因此在本實驗中可以特異性檢測Cyt f。圖4 b）（Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ）結果所示，分子質量略小于FNR-1的條帶即為Cyt f，經比對與所謂的FNR-2條帶完全重合。這一結果進一步證明了FNR-2條帶為Cyt f所產生的假陽性條帶，其產生的原因是選擇了不合適的HRP標記的二抗。

2討論

WB技術是目前進行蛋白質表達分析研究中應用最多的一項技術，是將傳統高分辨率的SDS-PAGE電泳和靈敏度高、特異性強的免疫探測技術相結合，最有效地分析目的蛋白的表達，在分子生物學中發揮著重要作用[20]。WB的高靈敏度和二抗的標記物關系密切，特別是HRP標記物，其靈敏度甚至可以檢測pg水平含量的目的蛋白，因此HRP標記的二抗在WB研究中的應用十分廣泛。但是，高的靈敏度往往會產生假陽性問題，WB中產生假陽性現象的原因多種多樣。在本研究中，筆者針對HRP顯色機理（即利用其氧化還原酶特性，使無色的底物氧化為有色的產物），探討了WB實驗中不恰當使用二抗標記物產生的假陽性問題。本研究中的heme結合蛋白Cyt f，其經過電泳前的變性處理、SDS-PAGE和轉膜之后，依然保留一定的過氧化物酶活性[13，18]，本身就可以和顯色液反應，從而產生顯著的假陽性條帶，干擾對結果的判斷。例如，有文獻研究報道，菠菜中提取的Cyt b6f粗制品中，WB檢測出現2條FNR條帶，位置和本研究中的FNR-1和FNR-2相對應[19]。根據本研究結果，這很可能是由于HRP標記的二抗導致實驗結果出現了假陽性，令研究人員作出了錯誤的判斷。

為了減少WB實驗中的假陽性，某些情況下，需要考慮選擇何種標記物偶聯的二抗。有的研究者運用WB技術檢測蛋白磷酸化情況時，往往推薦使用HRP標記的二抗，而避免使用ALP標記的二抗。這是因為ALP對磷酸酯的水解作用會使被檢測的磷酸化蛋白發生變化，影響實驗結果。本研究則表明，如果被檢測蛋白為heme結合蛋白或者混有少量heme結合蛋白，應避免采用HRP標記的二抗，使用ALP標記的二抗或者其他二抗產品。

需要說明的是，heme有a，b，c共3種類型，Cyt f結合的heme屬于c型，本研究沒有檢測結合a型或b型的蛋白是否也會產生假陽性結果。但是根據文獻報道，結合heme基團的蛋白均會表現出一定的過氧化物酶活性[18]。在接下來的工作中，將驗證結合a型和b型heme的蛋白是否也會產生假陽性。另外，還需要注意的是，不僅僅是heme結合蛋白，其他一些類型的氧化還原酶，比如結合銅離子的氧化還原蛋白，在SDS-PAGE之后仍然表現出一定的氧化還原酶活性[21]。在運用WB技術檢測、分析這類蛋白時，如果使用HRP標記的二抗，很可能也會產生假陽性，影響對實驗結果的判斷。因此，仍需要對這類氧化還原酶進行進一步驗證，以便為相關研究人員提供更有價值的參考和借鑒。

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2019年6月Journal of Hebei University of Science and TechnologyJune 2019