一例雞傳染性法氏囊病病毒的分子鑒定

吉 濤，曹 晶，陸冰洋

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

雞傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是通過感染雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）而引起發(fā)病[1]，雞傳染性法氏囊病病毒在病毒學(xué)分類中屬于雙股雙階段RNA病毒[2]，可以對(duì)雛雞的免疫器官即法氏囊造成破壞，從而引起免疫抑制。雞傳染性法氏囊病造成禽類發(fā)病具有急性發(fā)病、高度接觸性感染等特征[3]。IBDV由A和B共2個(gè)RNA片段組成（A片段堿基長(zhǎng)度大約為3.4 kb，其含有2個(gè)部分重疊的開放閱讀框（ORF）。其中，大的開放閱讀框（ORF）編碼vp2-vp4-vp3聚合蛋白，其分子質(zhì)量為110 ku，然后斷裂成vp2、vp4、vp3 3種蛋白。vp2分子質(zhì)量為48 ku；vp4分子質(zhì)量為29 ku；vp3分子質(zhì)量為33 ku[4-5]；小開放閱讀框（ORF）編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白vp5。B片段堿基長(zhǎng)度大約2.85 kb，編碼vp1，vp1分子質(zhì)量為91 ku[6-9]）。vp3基因是雞傳染性法氏囊病病毒的一個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒衣殼的主要構(gòu)成成分，含有雞傳染性法氏囊病病毒的特異性抗原決定簇，該抗原決定簇具有線性依賴性的特性，也具有中和抗原表位，但數(shù)量不多，具有相當(dāng)?shù)拿庖弑Ｗo(hù)力[10]。

近年來，隨著雞傳染性法氏囊病超強(qiáng)毒（Very virulent infectious bursaldisease virus，vvIBDV） 的出現(xiàn)，能夠使疫苗免疫失敗[11-13]，目前有效的防治手段有卵黃抗體[14]等，雞傳染性法氏囊病已經(jīng)成為能夠廣泛對(duì)世界性包括我國(guó)在內(nèi)的養(yǎng)禽業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失的重要病原之一[15-18]。所以，對(duì)雞傳染性法氏囊病的防控與診治提出了更高的要求，對(duì)雞傳染性法氏囊病進(jìn)行早期準(zhǔn)確的診斷具有相當(dāng)重要的意義和價(jià)值。

本研究利用PRC技術(shù)針對(duì)疑似IBD進(jìn)行分子鑒定，并對(duì)IBDVvp3基因進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，分析研究地區(qū)IBDV的流行趨勢(shì)，旨在為IBD防治提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步建立高特異性鑒別診斷分子生物學(xué)方法提供條件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 某規(guī)模化雞場(chǎng)雛雞群發(fā)病，病初精神沉郁，排白色水樣稀糞，脫水、虛弱、死亡。剖檢可見，法氏囊呈黃色膠胨樣水腫、黏膜上覆蓋纖維素性滲出物；腎腫脹，充滿白色尿酸鹽，脾臟及腺胃和肌胃交界處黏膜出血。無菌采集病料，1 mL PBS加肝臟研磨1 min，6 000 r/min離心，取上清，低溫保存。

1.1.2 主要試劑 鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）和RNase inhibitor，DNA marker 和 PCR kit均購(gòu)自TAKARA公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank登錄的IBDVvp3基因，參考雞傳染性法氏囊病病毒序列，經(jīng)Primer5對(duì)vp3基因序列設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)引物：F：5′-CGTTTCCCTCWCAATCCACG-3′；R：5′-CT CAAGGTCCTCATCAGAGAG-3′。

1.2.2 病毒RNA的提取及vp3的擴(kuò)增 參照RNA常規(guī)提取方法，取1.1.1病毒上清液250 μL，加入Trizol 750 μL，劇烈振蕩 15 s混勻，靜置 5 min。加入150 μL氯仿振蕩30 s混勻，4℃離心機(jī)12 000 r/min離心5 min。取上清液加入500 μL的異丙醇，上下顛倒混勻，4℃離心機(jī)12 000 r/min離心20 min，棄去上清；抽取-20℃預(yù)冷75%DEPC乙醇1 mL加入沉淀中洗滌，4℃離心機(jī)12 000 r/min離心5 min，棄去液體；虹吸，干燥沉淀，加20 μL DEPC水，水浴鍋中50℃水浴10 min，開始反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為：1 μL random primer，10 μL RNA 模板和 4 μL dNTP，混勻后65℃水浴10 min，迅速取出放入冰浴 5 min，加入 1 μL M-MLV，4 μL 反應(yīng) Buffer和1 μLRNase inhibitor，37 ℃水浴 2 h。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，加入vp3特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR體系：dNTP 4 μL，PCR 反應(yīng) Buffer 5 μL，cDNA 模板5 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL ，DNA 聚合酶1 μL，Mg2+5 μL，ddH2O 26 μL，PCR 反應(yīng)為 50 μL體系。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min；55℃退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物送華大公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3vp3序列分析 根據(jù)vp3片段測(cè)序結(jié)果，利用DNAstar軟件對(duì)其核苷酸高變區(qū)序列及vp3堿基序列推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中登錄的其他IBDV參考毒vp3片段進(jìn)行比較分析。參考名稱（登錄號(hào)）為：IBD疫苗毒株CEF94（AF194428.1）；IBD中等毒力致弱毒株IZO-2512（JQ315171.1），B87（DQ906921.1）；IBD標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)典強(qiáng)毒株Ⅱ型毒株OH（U30818.1），ORF's（Z21971.1），52/70（D00869.2）；IBD超強(qiáng)毒株韓國(guó)KSH（JQ315171.1），香港HK46（AF092943.1），日本 OKYM（D49706.1）；變異株 Variant E（AF133904.1）；經(jīng)典弱毒株 D78（AF499929.1），Cu-1（X16107.1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 vp3擴(kuò)增結(jié)果

提取雞傳染性法氏囊病肝臟研磨上清液中病毒RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄取得cDNA后，以雞傳染性法氏囊病病毒vp3特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可知，目的片段約831 bp（圖1），與預(yù)期大小相符。

2.2 IBDVvp3同源性分析

測(cè)序結(jié)果表明，IBDVvp3基因核苷酸長(zhǎng)度為831 bp。使用DNAstar分析軟件將雞傳染性法氏囊病病毒vp3基因與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的vp3基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明，雞傳染性法氏囊病病毒vp3核苷酸序列與香港超強(qiáng)毒株HK46（AF092943.1）和日本超強(qiáng)毒株 OKYM（D49706.1）的同源性最高，為98.9%與97.5%；與疫苗株CEF94（AF194428.1），Cu-1（X16107.1），經(jīng)典弱毒株 D78（AF499929.1）和 IZO-2512（JQ315171.1）同源性相近，分別為94.8%，94.8%，94.7%和94.7%；與中等毒力致弱株B87（DQ906921.1）和經(jīng)典強(qiáng)毒株52/70（D00869.2）同源性為94.4%和94.3%；與變異株Variant E（AF133904.1）同源性為 93.8%；與Ⅱ型毒株 OH（U30818.1）和 ORF's（Z21971.1）同源性最低，為 84.8%（圖 2）。

同時(shí)對(duì)IBDVvp3氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，IBDVvp3氨基酸序列與日本超強(qiáng)毒株 OKYM（D49706.1） 和香港超強(qiáng)毒株 HK46（AF092943.1）的同源性較高，為96.9%和96.2%；與疫苗株 CEF94（AF194428.1）、弱毒株 Cu-1（X16107.1）、經(jīng)典弱毒株D78（AF499929.1）、中等毒力致弱株I ZO-2512（JQ315171.1）、中等毒力致弱株 B87（DQ906921.1）、標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)典強(qiáng)毒株 52/70（D00869.2）、變異株Variant E（AF133904.1）同源性分別為94.7% ，94.7% ，94.7% ，94.3% ，93.9% ，93.1% 和91.2%；與Ⅱ型毒株 ORF's（Z21971.1）和 OH（U30818.1）同源性較低，為90.5%和88.9%。表明IBDVvp3在氨基酸水平上與超強(qiáng)毒株日本OKYM（D49706.1）和超強(qiáng)毒株香港 HK46（AF092943.1）關(guān)系密切（圖3）。

2.3 IBDVvp3遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)雞傳染性法氏囊病病毒vp3核苷酸序列與雞傳染性法氏囊病病毒參考毒株相應(yīng)序列，使用DNAstar MegAlign構(gòu)建基因進(jìn)化樹進(jìn)行分析，結(jié)果表明，所選取的雞傳染性法氏囊病病毒參考毒株和檢測(cè)陽(yáng)性毒株分成兩大分支：血清Ⅰ型和血清Ⅱ型，其中，血清Ⅰ型由4個(gè)部分構(gòu)成，血清Ⅱ型由2個(gè)部分構(gòu)成；IBDVvp3與香港超強(qiáng)毒株和日本超強(qiáng)毒株親緣關(guān)系最近，與變異毒株Variant E和經(jīng)典強(qiáng)毒株52/70親緣關(guān)系次之，與雞傳染性法氏囊病病毒中等毒力毒株和弱毒毒株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，但是和雞傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒株韓國(guó)KSH的親緣關(guān)系與中等毒力毒株和弱毒毒株親緣關(guān)系相仿（圖 4）。

3 結(jié)論與討論

本研究通過設(shè)計(jì)引物對(duì)IBDVvp3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增結(jié)果為831 bp，編碼277個(gè)氨基酸，與預(yù)期目標(biāo)相符。將IBDVvp3基因序列測(cè)定結(jié)果與GenBank經(jīng)典參考毒株進(jìn)行核苷酸和氨基酸比對(duì)分析，結(jié)果表明，IBDVvp3基因在核苷酸水平和氨基酸水平2個(gè)方面均與日本超強(qiáng)毒株和香港超強(qiáng)毒株同源性最高，分別為98.9%，97.5%和96.9%，96.2%，表明該病毒在分子水平上屬于IBDV。

我國(guó)對(duì)于雞傳染性法氏囊病一直采用疫苗注射預(yù)防為主的防治技術(shù)，由于雞傳染性法氏囊病超強(qiáng)毒株和強(qiáng)毒變異株的出現(xiàn)，雞傳染性法氏囊病病毒能夠突破和損壞禽類免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致雞傳染性法氏囊病的免疫失敗屢次發(fā)生，給雞傳染性法氏囊病的防治及控制其他傳染病繼發(fā)感染帶來巨大的困難。本研究通過對(duì)山西地區(qū)雞傳染性法氏囊病病毒vp3基因進(jìn)行分子鑒定，以期為傳染性法氏囊病的免疫防治方法提供相應(yīng)參考。