超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定食品中多種真菌毒素含量的方法研究

裘鈞陶 ， 鐘世歡 ， 葉磊海 ，應(yīng)寒松 ， 楊 娜 ， 詹越城 ， 王慶齡 ， 葉佳明

（1.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江 杭州 310009；2.贊宇科技股份有限公司，浙江 杭州 310009）

真菌毒素（Mycotoxin），也稱霉菌毒素，是由產(chǎn)毒絲狀真菌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物，包含多種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)，能誘發(fā)人畜各種生理損害[1-3]。已知有200多種不同的真菌毒素，常見的真菌毒素包括黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素 A、嘔吐毒素T-2毒素、伏馬毒素、展青霉素等。

真菌毒素是各種糧食及農(nóng)副產(chǎn)品的主要污染物之一。農(nóng)產(chǎn)品因污染嚴(yán)重而失去營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。動(dòng)物被喂食真菌毒素污染的谷物及飼料后，其組織（如牛羊肉、動(dòng)物肝臟、牛奶、雞蛋等）中可能會(huì)殘留真菌毒素，通過食物鏈逐級(jí)傳遞給食用者，對(duì)食用者的健康構(gòu)成潛在危害。這些真菌毒素不僅具有致癌、致畸和致突變等作用，還具有肝細(xì)胞毒性、中毒性腎損害、生殖紊亂和免疫抑制等危害，對(duì)機(jī)體造成永久性損害甚至死亡，對(duì)人類和動(dòng)物健康造成極大威脅[4-5]。因此，為監(jiān)測(cè)食品污染程度，需加強(qiáng)對(duì)真菌毒素檢測(cè)力度。通過建立簡(jiǎn)單、可靠、快速、靈敏的定性和定量真菌毒素的檢測(cè)方法，對(duì)于保障食品安全、減少人群的真菌毒素暴露危險(xiǎn)，具有十分重要的意義。

目前，檢測(cè)食品中真菌毒素的方法有很多，主要包括薄層色譜法 （TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 等。但是，這些方法存在著一定缺陷。如薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法只是半定量方法，液相色譜法定量較為準(zhǔn)確，但其選擇性較差，定性能力不足，靈敏度也達(dá)不到要求，而且這些方法都只能檢測(cè)某一種或者某一類最多4種真菌毒素，尚未涉及多成分同時(shí)檢測(cè)的方法。隨著HPLC-MS/MS儀器的成功應(yīng)用，利用其專屬性強(qiáng)、選擇性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)等優(yōu)勢(shì)，可彌補(bǔ)了前述方法的不足，對(duì)多組分同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，使該技術(shù)在分析檢驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。因此，試驗(yàn)旨在優(yōu)化多種真菌毒素同時(shí)測(cè)定的預(yù)處理，增強(qiáng)靈敏度和穩(wěn)定性并提高方法適應(yīng)性，使其適合檢測(cè)任務(wù)。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 儀器與試劑

AB4500型液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧（ESI） 離子源；AR2140型電子分析天平、KS-300EI型超聲波清洗器，寧波海曙科生超聲設(shè)備公司產(chǎn)品；Centrifug-5804R型臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；N-EVAP 11型氮吹儀，美國(guó)Organomation associates Inc公司產(chǎn)品；milli-Q型純水儀，美國(guó)millpore公司產(chǎn)品；ChunGX-274型固相萃取裝置，Oasis PriME HLB（3 cc/6 mg），美國(guó) Waters公司產(chǎn)品；華安麥科七合一免疫親和柱。

乙腈、甲酸、甲醇，均為色譜純；乙酸銨，為分析純。

乙腈-水-乙酸（80∶19∶1，V∶V∶V），量取800 mL乙腈，加入到190 mL水中，再加入10 mL乙酸，混勻。

80%甲醇：量取800 mL甲醇，加入到200 mL水中，混勻。

稀釋液：稱取 8 g NaCl，0.2 g KCl，0.2 g KH2PO4和 1.16 g Na2HPO4·12H2O， 加入 800 mL 超純水并定容至1 L。

洗滌液（0.1%Tween-20水溶液）：移取 1 mL Tween-20，用純水稀釋并定容至1 L。

洗脫液（2%乙酸-甲醇）：移取 2 mL乙酸，加入到98 mL甲醇中，混勻。

黃曲霉毒素 B1， B2， G1， G2， M1， M2， 伏馬毒素B1，B2，B3，赭曲霉毒素A和B，玉米赤霉烯酮，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，α-玉米赤霉醇，β-玉米赤霉醇，玉米赤霉酮，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉烯醇，3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，展青霉素，T-2毒素，HT-2毒素23種標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心（純度均大于 98.5%）。

分別稱取適量黃曲霉毒素 B1， B2， G1， G2，M1，M2，伏馬毒素 B1，B2，B3，赭曲霉毒素 A和 B，玉米赤霉烯酮，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，α-玉米赤霉醇，β-玉米赤霉醇，玉米赤霉酮，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉烯醇，3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，展青霉素，T-2毒素，HT-2毒素23種標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配置成質(zhì)量濃度為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃避光保存；量取1.0 mL，于100 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，配置成質(zhì)量濃度為100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，試驗(yàn)中根據(jù)需要配置標(biāo)準(zhǔn)工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.2 試驗(yàn)條件

1.2.1 樣品前處理

樣品經(jīng)粉碎后，稱取25 g（準(zhǔn)確至0.01 mg） 于250.0 mL錐形瓶中，加乙腈-水-乙酸（80∶19∶1，V∶V∶V） 混合液 100 mL，超聲提取 30 min，離心后傾出提取液，用80%甲醇重復(fù)提取殘?jiān)?次，合并提取液，取10 mL混勻后的液體，加入70 mL稀釋液，渦旋混勻，用微纖維濾紙過濾后，取32 mL濾液（相當(dāng)于0.5 g樣品） 用于上樣檢測(cè)。

取出免疫親和柱，去掉上方塞子，接上5 mL注射器，取適量上述處理后的濾液上樣。去掉親和柱下方堵頭，調(diào)節(jié)開關(guān)，使液體以1～2滴/s的速度流出。待所有上述濾液排干后，用超純水洗滌2次，每次10 mL，流速2～3滴/s（當(dāng)親和柱填料上顏色附著較深，需先用洗滌液10 mL洗滌，再用超純水10 mL洗滌）。液體排干后，再加入2 mL洗脫液（乙酸∶甲醇=2∶98），堵上親和柱下方堵頭，靜置3 min，然后以1滴/s流速洗脫，收集洗脫液。排干后，再加入1 mL洗脫液， 堵上親和柱下方堵頭，靜置3 min， 然后以1滴/s流速洗脫， 收集洗脫液并與上一步洗脫液合并，并將收集到的洗脫液在50℃下用氮?dú)獯蹈桑?0%甲醇溶液復(fù)溶，用0.22μm濾頭過濾后供LC/MS/MS檢測(cè)。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱；3.0×50mm，2.7μm。

流動(dòng)相：A：5 mol/L乙酸銨 B：CH3CN。

流速0.3 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量5μL。流動(dòng)相色譜條件見表1。

表1 流動(dòng)相色譜條件

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+-），有10種物質(zhì)采用ESI-，13種采用ESI+；噴霧壓力55 psi，干燥氣流速9 L/min，干燥氣溫度550℃，毛細(xì)管電壓4 500 V。

真菌毒素電離方式、質(zhì)譜參數(shù)、線性方程、相關(guān)關(guān)系、線性范圍、檢出限、定量限見表2。

表2 真菌毒素電離方式、質(zhì)譜參數(shù)、線性方程、相關(guān)關(guān)系、線性范圍、檢出限、定量限

2 結(jié)果與分析

2.1 提取和凈化條件的優(yōu)化

真菌毒素種類繁多主要分為以下幾類：黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等，試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)物基本涵蓋以上幾類。目前，霉菌毒素的提取方法主要以甲醇、乙腈及其與水的混合溶液為提取劑。玉米赤霉醇及其類似物為脂溶性物質(zhì)，不溶于純水，溶于堿性水溶液和大多數(shù)有機(jī)溶劑，文獻(xiàn)報(bào)道的常用提取溶劑有乙醚、乙腈、叔丁基甲醚等。黃曲霉毒素類真菌毒素難溶于水，易溶于油及甲醇、丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑，文獻(xiàn)報(bào)道的常用提取溶劑為乙腈-水的混合溶劑。研究在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，比較了70%，75%，80%，85%（V/V） 的乙腈-水溶液的提取效率，得出80%乙腈提取效果最佳。又在提取液里加入1%和2%乙酸比較3種提取液的提取效果，并對(duì)提取方法、提取時(shí)間等條件進(jìn)行了研究，確定最佳條件。結(jié)果表明，乙腈-水-乙酸 （80∶19∶1，V∶V∶V） 溶液對(duì)各霉菌毒素的提取效果總體效果最佳，選擇作為提取液。

由于糧食等食品中含有大量淀粉糖類及磷脂、脂肪等親脂性雜質(zhì)的存在，極大地干擾目標(biāo)化合物的分析，同時(shí)降低色譜柱壽命，也增大儀器系統(tǒng)的維護(hù)成本和難度。固相萃取凈化方法是復(fù)雜基質(zhì)中痕量檢測(cè)進(jìn)行凈化的常用方法。大部分文獻(xiàn)的樣品凈化中常采用的萃取小柱為將目標(biāo)待測(cè)物吸附后再進(jìn)溶劑洗脫的方式。此方法若選擇了專一性較強(qiáng)的萃取小柱對(duì)測(cè)定某種或某類化合物效果較好，但若用于多組分中性質(zhì)差異較大的樣品，往往對(duì)某些組分的吸附性較差而得不到滿意的效果。未能滿足性質(zhì)差異較大的多種真菌毒素殘留測(cè)定，簡(jiǎn)化前處理過程，試驗(yàn)選擇可有效吸附所有的待測(cè)物而磷脂及非極性干擾物無吸附的免疫親和柱進(jìn)行試驗(yàn)取得了滿意的結(jié)果。研究采用MAX，HLB，MCX固相萃取柱和七合一免疫親和柱幾種不同類型的萃取小柱進(jìn)行樣品凈化處理比較。HLB有比較好的凈化和吸附能力，但是基質(zhì)效應(yīng)比較嚴(yán)重，離子抑制效應(yīng)較強(qiáng)，而且玉米赤霉烯酮的回收率穩(wěn)定性較差，無法準(zhǔn)確定量。而MAX和MCX對(duì)于化合物的離子選擇性較高，這23種真菌毒素種類復(fù)雜，單用這2種固相萃取小柱難以面面俱到，導(dǎo)致有些化合物的回收率極差。而七合一免疫親和柱可同時(shí)吸附樣品提取液中的所有真菌毒素，從而對(duì)這23種毒素起到非常好的純化作用。因此，項(xiàng)目利用華安麥科的七合一免疫親和柱，吸附所有的待測(cè)物，而磷脂及非極性干擾物無吸附等特性，這樣既能使干擾物有效去除，又確保了所有待測(cè)組分無損失，同時(shí)又簡(jiǎn)化了操作步驟。故試驗(yàn)采用七合一免疫親和柱進(jìn)行樣品的凈化。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)考查了甲醇和乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的分離效果接近，峰形均可接受，但是它們的質(zhì)譜響應(yīng)有差別：乙腈作流動(dòng)相時(shí)噪音較小，各成分響應(yīng)較佳，綜合考慮，采用乙腈作為分析用流動(dòng)有機(jī)相。同時(shí)試驗(yàn)考查了質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液、超純水、濃度5 mmol/L乙酸銨的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液或超純水作為水相流動(dòng)相時(shí)，總有幾種物質(zhì)的響應(yīng)無法達(dá)到要求，而采用濃度5 mmol/L乙酸銨的時(shí)候則能很好地改善這種情況，故最終確定流動(dòng)相添加劑為5 mmol/L乙酸銨，后通過優(yōu)化梯度，23種真菌毒素在23 min內(nèi)全部出峰。

總離子流圖見圖1。

圖1 總離子流圖

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為了提高分析的靈敏度和高選擇性，選用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)目前食品檢測(cè)法規(guī)的要求，同時(shí)檢測(cè)兩對(duì)傳輸離子通道，進(jìn)行定性和定量分析。關(guān)于質(zhì)譜條件的優(yōu)化采用直接接二通方式進(jìn)行，用0.7 mL/min的流速將真菌毒素類工作液注入電噴霧離子源，通過全掃描方式得到真菌毒素的母離子（m/z），針對(duì)母離子（m/z） 的裂解電壓進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的裂解電壓。對(duì)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（子離子）掃描，獲得二級(jí)質(zhì)譜信息，通過母離子碰撞掃描發(fā)現(xiàn)兩對(duì)具有較高的豐度子離子，分別作為定性離子定量離子，然后在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下對(duì)碰撞能進(jìn)行優(yōu)化，使分子離子和特征子離子強(qiáng)度達(dá)到最佳，進(jìn)一步優(yōu)化毛細(xì)管電壓、霧化器壓力、干燥器溫度和流速等質(zhì)譜參數(shù)使離子化效率達(dá)到最佳。

2.4 線性關(guān)系和檢出限的考查

在試驗(yàn)所確定的色譜和質(zhì)譜條件下，對(duì)真菌毒素進(jìn)行測(cè)定，用空白基質(zhì)配置一系列質(zhì)量濃度為1～10， 5～50， 10～100 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，通過向陰性樣品中添加目標(biāo)物來考查方法的檢出限 （S/N=3）、定量限 （S/N=10），線性回歸方程、線性關(guān)系，以及檢出限、定量限和線性范圍。

2.5 方法回收率和精密度驗(yàn)證

對(duì)陰性樣品分別進(jìn)行3個(gè)質(zhì)量濃度6次加標(biāo)回收試驗(yàn)考查回收率和精密度，在線性范圍內(nèi)選擇5，10，20倍檢出限3個(gè)濃度進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，方法平均回收率為75.9%～108.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%～9.6%，該方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

選取了市售的糧食類食品共10份，進(jìn)行真菌毒素含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)市售樣品中有花生樣品檢出黃曲霉毒素B1和面粉中檢出脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，其含量小于限量值，可放心食用。

3 結(jié)論

建立了HPLC-MS/MS法測(cè)定糧食中黃曲霉毒素B1， B2， G1， G2， M1， M2， 伏馬毒素 B1， B2， B3， 赭曲霉毒素A和B，玉米赤霉烯酮，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，α-玉米赤霉醇，β-玉米赤霉醇，玉米赤霉酮，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉烯醇，3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，T-2毒素，HT-2毒素，展青霉素等23種真菌毒素的檢測(cè)方法。該項(xiàng)目?jī)?yōu)化了前處理提取、凈化、色譜和質(zhì)譜條件，使其有良好的分離度。同時(shí)，該方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，節(jié)省大量的人力物力資源和時(shí)間，為監(jiān)管和品質(zhì)控制提供了有利的技術(shù)支持，可用于實(shí)際樣品的測(cè)定。