揚麥17/寧麥18的F2群體株高QTL定位及分析

胡文靜，梁秀梅，高致富，高德榮，程順和

(1.江蘇里下河地區農業科學研究所/農業農村部長江中下游小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，江蘇揚州 225007；2.河南農業大學/河南糧食作物協同創新中心，河南鄭州 450002)

我國小麥品種中常用的矮稈基因有Rht1、Rht2和Rht8[1-2]。其中Rht1和Rht2來自農林10號，為隱性半致矮基因，是赤霉素反應遲鈍型矮稈基因，分別位于小麥染色體4B和4D短臂上，Rht8來自日本赤小麥(Akakomugi)，位于小麥2D染色體短臂上，對赤霉素反應敏感[3]。近年來，小麥矮稈基因的遺傳基礎研究取得了顯著進展，Rht1(Rht-B1b)、Rht2(Rht-D1b)、Rht3(Rht-B1c)和Rht10(Rht-D1c)分別被克隆[4-5]，其他矮稈基因的研究也取得了一定的進展[6-7]，不同學者利用分子標記相繼定位出50多個株高相關QTL[8]。不同的矮稈基因對農藝性狀具有不盡相同的影響。唐 娜等[9]研究表明，Rht8對小麥品種的有效分蘗以及千粒重沒有負面影響，同時還增加了穗粒數，尤其是提高了穗頂部和穗基部的結實率。另有研究發現，赤霉素不敏感型矮稈基因雖然通過增加穗粒數可以增加產量，但卻降低了粒重和蛋白質含量[10]，一部分矮稈基因在降低株高的同時降低了小麥的水分利用效率[8]，另外有一部分矮稈基因會引起小麥生物產量大幅下降[11]。

眾所周知，矮稈基因在小麥遺傳改良中發揮了重要作用，矮化育種有賴于矮源和矮稈基因的發掘和利用。目前生產中應用的小麥品種遺傳背景狹窄，僅有少數矮稈基因能被應用于小麥育種中[12]。因此，深入分析新型矮稈基因的遺傳效應，明確其應用價值，創造或篩選新的矮稈種質，對拓寬小麥矮源和促進小麥矮化育種都具有重要的作用。

揚麥17是江蘇里下河地區農業科學研究所育成的優質多抗小麥品種，寧麥18是江蘇省農業科學院育成的高產抗病小麥品種[13]。本研究以揚麥17和寧麥18創制的310個F2植株為材料構建遺傳連鎖圖譜，并結合F2和F2:3群體的田間表型數據進行小麥株高性狀的QTL定位及分析，以期發掘新的株高性狀QTL，為矮稈新材料的培育和矮稈新基因的挖掘提供理論和技術 支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

供試群體親本為普通小麥品種揚麥17和寧麥18。揚麥17由江蘇里下河地區農業科學研究所育成，株高88～91 cm，莖稈韌性很好，抗倒、抗病、優質、多穗。寧麥18由江蘇省農業科學院育成，株高83～86 cm，矮稈、大穗。本研究以寧麥18為父本、揚麥17為母本雜交獲得F1代，F1自交得到310株F2植株，F2按單株收，繁殖獲得F2:3群體。

1.1.2 引物

參考Roder等[14]、Song等[15](http://www.scabusa.org)、Sourdille等[16]、Guyomarc’h等[17]和Li等[18]提供的序列信息，選取可覆蓋小麥大部分基因組的2 403對不同來源的SSR引物。引物由上海捷瑞生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗和表型調查

親本材料、F2植株及其F2:3家系分別于2015-2016年度、2016-2017年度連續兩個生長季節種植于江蘇里下河地區農業科學研究所灣頭基地試驗田。其中，F2群體按單株種植；F2:3家系按株行種植，2次重復；行長1.3 m，行距35 cm，每行點播30粒，栽培管理同大田生產，小麥生長季未見嚴重病蟲害和倒伏。

小麥灌漿后期調查主莖株高。親本分別調查50株；F2群體調查每個單株；F2:3群體按株行調查，每行隨機選取10株，取平均值，并調查2個 重復。

1.2.2 DNA提取和PCR擴增

取親本和F2群體的苗期葉片，采用CTAB法提取DNA。PCR體系與程序參考Taq酶(北京天根生化科技有限公司)說明書，其中循環數為35，退火溫度視不同引物而定，延伸時間為45 s。采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 PCR擴增產物，銀染檢測，觀察記錄結果并拍照保存。

1.2.3 表型數據分析

利用Microsoft Excel 2007軟件對表型數據進行整理，利用SPSS 22.0對親本的株高進行獨立樣本t測驗，并對F2:3群體的株高性狀進行描述性統計分析。

1.2.4 連鎖圖譜的構建和QTL分析

利用JoinMap 4.0軟件并采用Kosambi函數構建遺傳圖譜，使用WinQTLCart 2.5軟件選擇復合區間作圖法進行QTL定位分析[19]，若LOD值>2.5，就認為該處存在一個有效的QTL，同時分析其加性效應、顯性效應和貢獻率。以“Q+性狀名稱縮寫+染色體名稱”的方式[20]對QTL進行命名。

2 結果與分析

2.1 表型性狀

統計分析顯示(表1)，兩個親本在株高性狀上表現為極顯著差異。F2和F2:3群體中的偏度和峰度的絕對值都小于1，即滿足正態分布(圖1)。同時，株高性狀存在明顯的雙向超親分離現象，表明均為多基因控制的數量性狀，適合進行QTL定位。

表1 親本及其F2和F2:3群體的株高表型數據Table 1 Phenotypic values for plant height of two parents,the F2 and F2:3 populations in wheat cm

**:雙親間差異極顯著(P<0.01)。

**：Significant difference between parents(P<0.01).

圖1 揚麥17/寧麥18 F2:3群體株高的表型分布

2.2 遺傳連鎖圖譜構建結果

參考梁秀梅[21]遺傳連鎖圖譜的構建，利用實驗室選取的2 403對SSR引物在揚麥17和寧麥18之間進行多態性篩選，得到330對在親本間具有多態性的引物，多態性引物檢出率為13.7%。采用JoinMap 4.0作圖軟件構建遺傳連鎖圖譜，將其中的215個SSR標記定位在19條染色體上(1D、6A未覆蓋到)，該圖譜共覆蓋1 717 cM，標記間平均距離為7.99 cM[21]。

2.3 QTL定位分析

應用復合區間作圖法共定位到8個株高QTL，分別位于小麥的2D、4B、5A、5B和7A上染色體上，其中，QPh-YN-2D.1、QPh-YN-5A.1、QPh-YN-5B.2和QPh-YN-7A四個QTL在兩個世代中均檢測到，QPh-YN-2D.2、QPh-YN-4B、QPh-YN-5A.2和QPh-YN-5B.1四個QTL僅在一個世代中檢測到。

QPh-YN-2D.1位于標記Xcfd53～Xgwm4080之間，染色體上遺傳位置是6.8 cM，在兩世代中可解釋的表型變異分別為2.84%和 6.37%，LOD值分別為2.56和5.75，矮稈效應增效等位基因來自寧麥18。QPh-YN-5A.1位于標記Xwmc415～Xbarc360之間，染色體上遺傳位置是44.9 cM，在兩世代中可解釋的表型變異分別為 14.36%和20.46%，LOD值分別為8.69和12.82，矮稈效應增效等位基因來自揚麥17。QPh-YN-5B.2位于標記Xgpw499～Xmag3262之間，染色體上遺傳位置是76.4 cM，在兩世代中可解釋的表型變異分別為4.26%和5.46%，LOD值均為3.51，顯性效應為負，矮稈效應增效等位基因來自寧麥18。QPh-YN-7A位于標記Xmag4044～Xmag3284之間，染色體上遺傳位置是16.5cM，在兩世代中可解釋的表型變異分別為2.15%和3.16%，LOD值分別為2.55和 4.38，矮稈效應增效等位基因來自寧麥18。

圖2 小麥株高性狀QTL在染色體上的分布

QPh-YN-2D.2僅能在F2世代中檢測到，位于標記Xgpw5092～Xgpw4450之間，染色體上遺傳位置是100.6 cM，與QPh-YN-2D.1相距93.8 cM，推測是不同的QTL，可解釋的表型變異為 5.05%，LOD值為4.59，矮稈效應增效等位基因來自寧麥18。QPh-YN-5A.2也僅能在F2世代中檢測到，位于標記Xgwm186～Xbarc303之間，染色體上遺傳位置是71.2 cM，與QPh-YN-5A.1相距26.3 cM，推測是相同的QTL，LOD值為3.51，可解釋的表型變異為7.72%，矮稈效應增效等位基因來自揚麥17。QPh-YN-5B.1僅能在F2:3世代中檢測到，位于標記Xgpw4463～Xgpw5206之間，染色體上遺傳位置是65.6 cM，與QPh-YN-5B.2相距10.8 cM，推測是同一QTL，LOD值為2.95，可解釋的表型變異為 4.62%，顯性效應為負，矮稈效應增效等位基因來自寧麥18。QPh-YN-4B也僅能在F2:3世代中檢測到，位于標記Xmag1163～Xgwm538之間，染色體上遺傳位置是2 cM，LOD值為4.89，可解釋的表型變異為11.24%，顯性效應為負，矮稈效應增效等位基因來自寧麥18。

表2 揚麥17/寧麥18的F2和F2:3群體株高的QTL定位結果Table 2 QTL mapping result for plant height in the F2 and F2:3 population of Yangmai 17/Ningmai 18

加性效應：正值表示增效基因來自揚麥17；負值表示增效基因來自寧麥18。顯性效應：正值表示雜合子表現值比兩純合子的平均表現值高，負值表示雜合子表現值比兩純合子的平均值表現值低。

Additive effect:Positive additive effect indicates increased effect from Yangmai 17,and negative additive effect indicates increase effect from Ningmai 18.Dominant effect:Positive values indicate that the heterozygotes have the higher phenotypic values than the respective means of the two homozygotes,and negative values indicate that the heterozygotes have the lower phenotypic values than the respective means of the two homozygotes.

3 討 論

3.1 QTL的比較分析

QPh-YN-5A.1在兩世代中可以解釋的表型變異為14.36%和20.46%，是一個穩定的主效QTL。已知矮稈基因Rht12位于5AL染色體上，緊密連鎖的分子標記是Xgwm291[22]，經過比對發現QPh-YY-5A.1與之相距較遠[16]。參考Wang等[23]90K芯片圖譜和中國春(CS)V1.0版本基因組(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)也發現QPh-YN-5A.1與已報道[24]的5A上株高QTL相距較遠。因此推測QPh-YY-5A.1是一個新的株高QTL。QPh-YN-5A.2僅能在F2世代中檢測到，與QPh-YN-5A.1相距26.3 cM，推測是相同QTL。QPh-YN-2D.1與已報道的2DS上矮稈基因Rht8的特異分子標記Xgwm261[25]遺傳距離僅6.8 cM，因此推測此QTL是Rht8的位點。QPh-YN-2D.2僅能在F2世代中檢測到，與QPh-YN-2D.1相距93.8 cM，推測是不同的QTL，與中國春比對發現QPh-YN-2D.2位于2DL上，不同于以往報道的株高QTL，推測是一個新的株高QTL。經過與中國春比對發現QPh-YN-5B.2位于5BL上，與葉亞瓊等[26]報道的Qph.acs5B相距較遠，推測是一個新的株高QTL。QPh-YN-5B.1僅能在F2:3世代中檢測到，與QPh-YN-5B.2相距10.8 cM，推測是同一QTL。經過與中國春比對發現QPh-YN-7A位于7AL上，與葉亞瓊等[26]報道的QPh.acs-7A.1距離相近，推測是同一個QTL。經過與中國春比對發現QPh-YN-4B位于4BS上。經基因型分析，Rht-B1b的KASP標記在寧麥18和揚麥17中均呈陽性，說明QPh-YN-4B不屬于Rht-B1b的位點，該位點未見報道[25,26-27]，推測是一個新的株高QTL。

3.2 矮稈基因的顯性或者上位性效應

比對結果表明，QPh-YN-4B和QPh-YN-5B分別是兩個新的株高QTL，顯性效應均為負值，表示后代中雜合子表現值比兩純合子的平均表現值低，說明這兩個矮稈基因具有一定的顯位效應或者上位性效應。

3.3 QTL的穩定性和表型貢獻率

定位到的8個QTL中，只有QPh-YN-2D.1、QPh-YN-5A.1、QPh-YN-5B.2和QPh-YN-7A能夠同時在兩世代中被檢測到，是穩定遺傳的QTL；QPh-YN-2D.2、QPh-YN-5A.2、QPh-YN-5B.1、QPh-YN-4B只能在單一世代被檢測到，而且大多數株高性狀QTL的貢獻率較低，只有QPh-YN-5A.1在兩世代表型貢獻率達到 14.36%和20.46%，QPh-YN-4B在F2:3世代中的表型貢獻率達到11.24%，其他株高QTL對表型的貢獻率均小于10%，這是因為株高性狀屬于數量遺傳性狀，并且供試群體F2和F2:3屬于低世代臨時性群體，F2世代僅調查單株主莖的表型性狀，易受環境影響，表型調查誤差大。我們后續會增加重組自交系群體多環境試點以增加結果的可靠性和穩定性，以期尋找到在不同環境下穩定表達的株高性狀QTL。

3.4 群體大小和圖譜密度對QTL檢測結果的影響

以往研究表明，QTL檢測結果受圖譜密度和圖譜長度的影響[28]。本研究所利用的揚麥17/寧麥18群體包括310個F2單株及F2:3家系，基于SSR標記構建的連鎖圖譜進行QTL檢測，最終有215個標記定位到小麥的19條染色體上，圖譜覆蓋1717 cM，標記間平均圖距為7.99 cM，由于SSR標記密度有限，遺傳連鎖圖譜沒有完全覆蓋到染色體，可能造成部分染色體上QTL的漏檢，我們后續會應用覆蓋小麥全基因組的55K芯片掃描重組自交系群體構建更加精密的遺傳連鎖圖普以增加QTL定位結果的可靠性。

3.5 QTL位點的緊密連鎖

矮稈QTLQPh-YN-5A.1與梁秀梅等[21]在5A上定位到的總小穗數QTL相距11.5～14.5 cM，增效等位基因都來自揚麥17，推測二者是連鎖QTL，另一矮稈QTLQPh-YN-2D.1與梁秀梅等[21]定位到的穗長QTLQSl-2D.2相距3～15 cM，增效等位基因都來自寧麥18，推測二者是連鎖QTL。利用這些緊密連鎖QTL，結合穩定表達的位點，通過回交和分子標記輔助選擇，可同時聚合控制多個性狀不同位點的等位基因，從而創制出優異的小麥種質資源。

致謝:感謝中國農業科學院作物科學研究所夏先春博士在KASP基因分型方面提供的技術支持。