熒光聚合酶鏈反應熔解曲線法快速檢測結核分枝桿菌及異煙肼耐藥突變的臨床應用價值

陽 央， 馮 智， 侯 歡， 李芳芹

結核病是危害人類健康的古老疾病，至今仍是全球十大死亡原因之一。據世界衛生組織2018年全球結核病控制報告，2017年中國新發結核病患者占世界的9%，平均感染人數63/100 000，位居全球第二，也是耐藥結核病發生最多的三大國家之一；耐多藥/利福平（RIF）耐藥結核病平均發生數5.2/100 000[1]，一例未治療的耐藥結核菌感染患者每年可以傳染10～15個人，耐藥結核病已成為全球結核病死灰復燃的重要原因，嚴重威脅公共衛生健康[2]。耐藥性出現和迅速蔓延的一個因素是缺乏快速診斷，因此，快速診斷耐藥結核病獲得菌株耐藥信息是控制結核病傳播和治療的關鍵。

異煙肼（INH）是結核病化療的基礎，是治療和預防最重要藥物，熒光聚合酶鏈反應（PCR）熔解曲線法是根據結核分枝桿菌野生型序列和突變序列不同熔點溫度（Tm）而產生不同熔解曲線設計，其基本原理是在一定環境下，雙鏈DNA在其長度和序列一定時，Tm值也一定，是其固有性質，當發生點突變、插入或缺失，Tm值下降，下降的幅度與發生點突變的類型、插入或缺失的堿基數目以及突變位點的位置有關；利用熒光標記的探針對耐藥突變的位點進行特異性擴增，然后做熔解曲線，通過與野生型菌株比較從而判斷是否發生突變。本研究意在探討此方法在臨床快速檢測結核分枝桿菌及其INH耐藥突變的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 標本來源 痰液標本來源于延安市傳染病醫院2018年4－12月住院的370例肺結核確診患 者。

1.1.2 儀器與試劑 MGIT320儀及配套試劑購于美國BD公司，Lab-Aid 824全自動核酸提取儀及SLSN-96實時熒光PCR儀購于上海宏石醫療科技公司，HC-2518R高速冷凍離心機購于安徽中科中佳公司，結核分枝桿菌DNA提取和結核分枝桿菌復合群（MTBC）檢測試劑及INH耐藥突變檢測試劑盒來自廈門致善生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測與突變評估 在P2+實驗室按照操作規程對痰液標本應用MGIT320進行液體培養及藥敏，采用磁珠法提取痰液中MTBC的DNA，實時熒光PCR儀進行MTBC及INH耐藥突變快速檢測。剔除培養法結核陽性和MTBC陽性，因含菌量低未進行表型藥敏與耐藥突變檢測或藥敏試驗失敗的菌株，以培養法藥敏為金標準，評估熔解曲線法耐藥突變檢測。

1.2.2 INH耐藥突變 INH耐藥突變根據靶序列的熔解變化檢測ahpC啟動區（-44～-30以及-15～3位點）、inhA94密碼子、inhA啟動區（-17～-8位點）、和KatG315密碼子是否突變。參照說明書判斷結果［四個通道任意一通道中樣品的熔點低于陽性對照2 ℃及以上時（ΔTm≥2 ℃）判斷為突變型］。

1.2.3 統計學方法 數據采用Excel統計處理，SPSS 22.0進行統計學分析，兩種方法差異性檢測采用McNemarχ2檢驗，采用Kappa檢驗分析兩種方法檢測結果一致性（Kappa≥0.8高度一致；0.6≤Kappa＜0.8 一致性較好；0.4≤Kappa＜0.6 一致性中等；Kappa＜0.4 一致性較差）。

2 結果

2.1 結核分枝桿菌檢出比較

370例肺結核患者，培養法檢出MTBC 175株，陽性率47.3%，其中148株進行了培養法表型藥敏試驗；熔解曲線法檢出157株，陽性率42.4%，其中128株進行了分子學藥敏試驗。兩種方法檢測MTBC的結果差異無統計學意義（P=0.073），一致性中等（Kappa=0.510），熔解曲線法檢測MTBC的靈敏度69.1%，特異度81.5%，見表1。

表1 熒光PCR熔解曲線法與MGIT320液體培養法檢測MTBC結果Table 1 Detection of Mycobacterium tuberculosis complex by fluorescence PCR melting curve analysis and MGIT320 mycobacterial liquid culture

2.2 INH耐藥結果比較

同時有藥敏結果的115株菌株進行比較，培養法20株耐藥，95株敏感；熔解曲線法25株耐藥，90株敏感，兩種方法檢測結果比較差異無統計學意義（P=0.125），具有高度一致性（Kappa= 0.807），熔解曲線法INH耐藥突變檢測靈敏度95.0%，特異度93.7%，見表2。

表2 INH耐藥突變與MGIT320液體培養法藥敏結果Table 2 Correlation between isoniazid resistance mutation detected by melting curve method and MGIT320 mycobacterial liquid culture and susceptibility testing

2.3 INH典型突變

25株INH耐藥突變株中熔解曲線法檢出17株KatG基因突變，其中1株合并ahpC啟動區突變，1株KatG基因缺失；3株inhA基因突變，5株為雜合樣品，典型KatG315突變熔解曲線見圖1，典型inhA突變熔解曲線見圖 2。

3 討論

隨著現代分子生物學技術的發展，越來越多檢測結核桿菌的分子生物學方法在臨床得到了廣泛應用，包括實時熒光定量PCR檢測DNA，線性探針技術，基因芯片，半巢式全自動熒光定量PCR（Xpert MTB/RIF）及熔解曲線法等，其中Xpert MTB/RIF為WHO推薦方法，但儀器及檢測價格昂貴，只能測定RIF耐藥情況。相比較，由我國自主研發的熒光PCR熔解曲線法試劑盒能同時對多種一線及二線抗結核藥物進行耐藥檢測[3]，能快速獲得較全面的耐藥信息。

圖1 KatG315突變熔解曲線Figure 1 The melting curve of KatG315 mutation

圖2 inhA突變熔解曲線Figure 2 The melting curve of inhA mutation

本研究中培養法與熔解曲線法檢出MTBC的結果無差異，熔解曲線法檢出MTBC的靈敏度69.1%，特異度81.5%，靈敏度低于新疆相關研究[4]。培養法檢出MTBC 54株陽性，而熔解曲線法MTBC檢測陰性，靈敏度低可能原因：①直接以痰標本提取結核菌DNA，某些痰標本不合格或含菌量低（痰含菌量＜200 CFU/ mL）達不到熔解曲線法檢測靈敏度下限，造成假陰性，而培養法通常每毫升痰含100條以上抗酸菌可得到陽性結果；②核酸提取時痰液液化不全，或消化后存在抑制物，如血痰標本擴增可能受抑制，而內標可能對抑制物檢測還存在一定局限，導致假陰性；③試劑盒反復凍融。熔解曲線法MTBC檢出36株，而培養法陰性，可能主要原因是熔解曲線法既能檢測死菌也能檢測活菌，而液體培養只針對活菌，因此，熔解曲線法不能有效區分是否為活動性結核；另外，有研究表明，液體培養法前期用NaOH處理痰液時會殺死部分結核菌，特別是菌量少的標本[5]，可能也是造成結果不一致的一個因素。

分枝桿菌最重要的耐藥機制是由于基因突變或外排泵的激活，而不是像其他細菌中常見的耐藥機制是由于獲得耐藥質粒或轉位子，耐多藥結核分枝桿菌，即至少同時耐INH和RIF的菌株，早在1985年就開始增多，INH耐藥的主要機制是katG（S315T）及inhA基因的突變[6]。katG基因編碼過氧化氫酶-過氧化物酶激活INH形成異煙酰陰離子或自由基，與NAD反應生成INH-NAD復合物，INH-NAD復合物抑制細胞壁分枝菌酸合成有關的靶點inhA蛋白，導致分枝菌酸生物合成的破壞和細菌死亡[7]。katG基因突變或缺失導致INH活化受阻，inhA突變導致INH作用靶點改變，從而產生耐藥，快速檢測INH耐藥突變有助于早期發現耐多藥結核病和廣泛耐藥結核病。

本研究中，培養法進行表型藥敏試驗檢測率84.6%（148/175），熔解曲線法進行分子學藥敏試驗檢測率81.5%（128/157），前者略高于后者，可能由于痰標本含菌量少，造成熔解曲線法MTBC檢測出現假陰性，因此，多次送檢也十分重要；另外，部分熔解曲線法檢測MTBC陽性，但是閾值循環數（Ct）值在23以上，我們未進行突變檢測，有研究表明，Ct值一旦高于23，很難進行突變檢測[8]。同時有INH藥敏結果的菌株進行統計學分析，兩種方法耐藥檢測結果差異無統計學意義，熔解曲線法INH耐藥突變檢測的靈敏度95.0%、特異度93.7%，高于杜鵬等[9]、劉艷等[4]研究。表型藥敏試驗耐藥而突變檢測陰性的可能原因：①試劑盒本身檢測存在局限，只針對ahpC啟動區、inhA94密碼子、inhA啟動區及katG315密碼子的突變，其他類型突變引起的耐藥無法檢測；②INH耐藥機制復雜，如藥物外排泵的改變，耐藥突變可能無法檢測；③可能存在異質性耐藥[10]（指同一標本中同時存在耐藥和敏感的菌株），因耐藥菌株所占比例較低（本試劑盒檢測突變下限為40%）或試劑盒本身缺陷，熔解曲線法檢測不到，INH異質性耐藥MGIT DST可以檢出預期1%耐藥菌[11]，而熔解曲線法檢出INH異質性耐藥通常突變比例下限20%～40%[3]，有研究說明異質性耐藥可能是多重耐藥結核菌和廣泛耐藥結核菌產生的先兆[12-13]，最近報道的一種高敏感檢測異質性耐藥的深度熔解法，能檢出1%突變菌株比例的INH異質性耐藥[14]，可能彌補目前分子學方法異質性耐藥檢測的困境；④液體培養法污染率較熔解曲線法的污染率高，因此，部分培養法藥敏結果存在假陽性的可能，同時目前耐藥突變試劑盒48人份/盒，如果每次檢測數量少，試劑盒反復凍融，可能導致檢測效能降低，造成假陰性。表型藥敏試驗敏感而突變檢測陽性的可能原因：①熔解曲線法只篩查核酸序列，部分不引起氨基酸改變的突變（沉默突變），會被判為突變型，而這種突變不會引起耐藥的生物學改變；②試劑盒從方法學上并不能區分具體突變位點，而某些突變位點可能并不引起耐藥；③可能與菌株的低濃度耐藥有關，導致藥敏結果敏感，而突變檢測陽性，特別是在部分inhA突變菌株中，inhA的突變與低濃度INH耐藥有關，本次3株inhA突變菌株中，1株藥敏結果敏感；④同時存在異質性耐藥或提取DNA不純，導致熔解曲線出現各種雜合峰或復雜熔解曲線，而雜合峰或復雜熔解曲線等的耐藥突變判斷受儀器性能及人工判斷的影響。本次實驗中，5株雜合樣品儀器自動判斷為耐藥，而藥敏結果均顯示敏感，對于雜合樣品最好重復進行檢驗。因此，臨床在INH突變檢測耐藥，而培養藥敏敏感時，特別是抗結核治療了一段時間和復治患者，此時檢測到的耐藥突變可能由于死菌引起，沉默突變或是與導致低濃度耐INH的突變等有關，是否需要改變治療方案需要謹慎，最好根據臨床抗結核效果和患者情況等因素決定是否改變，因為一些低濃度耐藥的患者可能受益于高劑量INH的治療[15]。本次實驗不足在于，未對存在差異的菌株進一步測序，進行比較的菌株有限，我們將繼續跟蹤研究，以期更精準詳盡的報告。綜上所述，臨床報告耐藥突變陰性時，并不一定代表菌株對抗菌藥物是敏感的，而報告耐藥突變時，臨床上抗結核治療可能也是有效的。

本次通過對痰液樣本直接檢測表明，雖然熒光PCR熔解曲線法試劑盒還存在一些局限，但不可否認它在快速診斷結核病和INH耐藥突變檢測中具有重要價值，熔解曲線法對INH耐藥突變檢測表現出高靈敏度和特異度，相信未來隨著分子生物技術的進一步發展，試劑盒和儀器的優化，快速、準確的分子藥敏方法，必將開啟抗結核治療的精準時代。