慢性阻塞性肺疾病大鼠IL-10、TNF-α及INF-γ檢測意義及與氣道阻力的相關性分析*

汪新龍 劉朝暉 丁巍 梁志科

（廣東省廣州市第一人民醫院急診科 廣州510180）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是以持續氣流受限為特征的氣道慢性異常炎癥反應性疾病[1]。可引起肺外各器官組織損害，在COPD的自然病程中，多種炎癥因子參與其中[2]。白介素10（Interleukin10,IL-10）為具有抑制炎癥反應的細胞因子，在炎癥反應中起重要作用[3]。腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）為一種多功能細胞因子，具有廣泛生物活性，是機體發生炎癥反應的重要介質，也是目前反應機體炎癥及組織損傷的敏感指標。干擾素-γ（INF-γ）為Th-1細胞分泌的一種特征性細胞因子，可誘導上皮細胞、單核細胞產生白介素等炎癥因子，破壞生理防御及免疫監測平衡，繼而誘導炎癥反應。本研究旨在分析慢性阻塞性肺疾病大鼠血清和肺組織中IL-10、TNF-α、INF-γ檢測意義及與氣道阻力的相關性。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 模型建立 選取自廣東省醫學動物實驗中心購買雄性大鼠45只，周齡均為8周，平均體質量為（221.95±6.45）g。采用隨機數字表法分為模型組30只，對照組15只。模型建立于試驗第1天及第15天，兩組均予以10%水合氯醛（國藥準字H37022673）4 ml腹腔注射，模型組緩慢向氣道內注射脂多糖 （LPS，美國Sigma公司生產，貨號：L2880）0.2 ml，每日 10:00和 15:00予以煙熏 30 min，持續4周；對照組緩慢注射生理鹽水0.2 ml，然后放入飼養籠，正常進食和進水，不予以煙熏處理。

1.2 大鼠肺功能及炎癥因子等指標的檢測 氣道阻力及肺順應性檢測采用美國Buxco公司生產的Buxco動物肺功能RC系統，尾尖取靜脈血0.5 ml留置真空抗凝管，4℃低溫離心10 min，3 500 r/min，取上清液用于檢測。兩組大鼠肺組織放入10%福爾馬林溶液中浸泡24 h，然后沿右肺門橫斷進行病理組織取材，采用石蠟包埋，二甲苯對組織標本進行脫蠟處理后先后采用乙醇和水進行沖洗，沖洗完成后蘇木精染色處理，1%鹽酸-乙醇分化液處理，然后伊紅染色，常規脫水，中性樹膠凝封，加PBS溶液，充分勻漿后制成勻漿液，充分離心后取上層清液。采用酶聯免疫吸附法（ELISA法）檢測IL-10、TNF-α及INF-γ水平。

1.3 統計學方法 數據處理采用SPSS13.0統計學軟件，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料用率表示，進行χ2檢驗，同時進行相關性，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察兩組肺組織形態學 （1）COPD模型組：肺組織顏色蒼白，體積增大，彈性差；肺組織表面無滲血情況，被膜下存在極個別出血點。鏡下觀察可見細支氣管管壁增厚，呼吸性支氣管狹窄或閉塞；纖毛倒伏，部分脫落；支氣管黏膜細胞變性、壞死、增生，黏膜下炎癥細胞大量浸潤，以淋巴細胞、漿細胞為主，部分為中性粒細胞；肺泡壁變薄，肺泡腔增大、破裂，或融合成肺大皰。見圖1-A。（2）對照組：肺組織表面光滑，質軟、色澤紅潤，彈性較好，未見滲血，且被膜下無出血。鏡下觀察未見模型組大鼠類似變化。見圖1-B。

圖1 大鼠肺組織病理變化（HE×100）

2.2 兩組大鼠肺功能及血氣指標觀察比較 （1）肺功能指標：模型組大鼠較對照組大鼠氣道阻力明顯升高，而肺順應性較對照組大鼠顯著降低，P＜0.01。（2）動脈血氣指標：模型組大鼠pH值、PaO2水平顯著低于對照組，PaCO2水平明顯高于對照組，P＜0.01。見表1。

表1 兩組大鼠肺功能及動脈血氣指標比較（±s）

表1 兩組大鼠肺功能及動脈血氣指標比較（±s）

動脈血氣指標p H P a O 2 P a C O 2（m m H g） （m m H g）模型組對照組組別 n肺功能指標氣道阻力 肺順應性[k p a/（m l·s）] （m l/c m H 2 O）3 0 1 5 t P 0.4 8 9±0.0 7 2 0.2 9 5±0.0 4 7 9.4 4 8＜0.0 1 0.3 6 2±0.0 6 1 0.5 2 8±0.0 5 6 8.8 3 5＜0.0 1 7.1 1±0.1 1 7.3 5±0.2 5 4.4 9 5＜0.0 1 6 8.8 4±1 0.1 5 9 5.6 2±7.6 9 8.9 9 0＜0.0 1 6 1.2 5±9.2 6 4 6.6 5±6.0 4 5.5 2 9＜0.0 1

2.3 兩組血清、肺組織炎癥因子水平比較 模型組血清、肺組織中IL-10水平較對照組明顯降低，TNF-α和INF-γ水平顯著升高，P＜0.01。見表2。

表2 兩組血清、肺組織炎癥因子表達比較（ng/L，±s）

表2 兩組血清、肺組織炎癥因子表達比較（ng/L，±s）

I N F-γ血清 肺組織模型組對照組組別 n I L-1 0血清 肺組織T N F-α血清 肺組織3 0 1 5 t P 4 4.6 9±8.6 7 7 5.9 5±1 0.5 9 1 0.5 8 5＜0.0 1 6 4.5 9±9.0 6 9 4.0 5±8.9 4 1 0.3 2 7＜0.0 1 7 1.9 1±6.4 5 4 5.5 6±5.6 2 1 3.4 1 1＜0.0 1 1 2 4.1 5±1 5.3 2 7 1.4 2±6.9 5 1 2.6 4 1＜0.0 1 9 0 7.1 5±1 4 2.6 2 6 4 5.2 5±2 8.4 5 9.7 8 2＜0.0 1 9 8 3.2 3±1 5 3.6 2 6 7 0.0 5±1 2 5.4 5 7.3 2 2＜0.0 1

2.4 COPD大鼠IL-10、TNF-α和INF-γ水平與肺功能指標相關性分析 COPD大鼠血清IL-10水平與氣道阻力呈負相關，r=-0.715，P＜0.01。見圖2。肺組織IL-10水平與氣道阻力呈負相關，r=-0.792，P＜0.01。見圖3。血清TNF-α水平與氣道阻力呈正相關，r=0.752，P＜0.01。見圖 4。肺組織 TNF-α 水平與氣道阻力呈正相關，r=0.749，P＜0.01。見圖5。血清INF-γ水平與氣道阻力呈正相關，r=0.801，P＜0.01。見圖6。肺組織INF-γ水平與氣道阻力呈正相關，r=0.835，P＜0.01。見圖 7。

圖2 COPD大鼠血清IL-10水平與氣道阻力相關性分析

圖3 COPD大鼠肺組織IL-10水平與氣道阻力相關性分析

圖4 COPD大鼠血清TNF-α水平與氣道阻力相關性分析

圖5 COPD大鼠肺組織TNF-α水平與氣道阻力相關性分析

圖6 COPD大鼠血清INF-γ水平與氣道阻力相關性分析

圖7 COPD大鼠肺組織INF-γ水平與氣道阻力相關性分析

3 討論

COPD是呼吸系統常見疾病，主要特征是慢性氣流受阻，且呈進行性進展。目前有關本病發病機制尚未確切，初步認為是氣道受阻、肺實質及肺血管慢性炎癥性損傷導致氣道及血管壁重塑是本病基本病理特征[4]。近年來，大量研究[5]證實嗜中性粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞等細胞因子參與本病發病過程中。本實驗通過向大鼠氣管內注射脂多糖，并反復香薰的方式建模，比傳統吸入SO2安全性高，比單純熏香煙需要的時間更短，研究符合COPD病情變化發展過程。本實驗通過對大鼠肺組織觀察證實，COPD模型大鼠具備和人類COPD患者類似的氣道非特異性炎癥及阻塞性通氣障礙，且結合生化實驗確定COPD大鼠模型建立成功。

TNF-α是多功能細胞因子，具有激活炎癥細胞以及增加毒性作用，同時還能釋放其他炎癥細胞趨化因子，引起氣道高反應性[6]。且TNF-α會加重炎癥反應，引起呼吸道細胞分裂增殖，促使氣道結構重塑及肺組織纖維化[7]。本研究結果顯示，模型組血清、肺組織TNF-α水平明顯較對照組高，可見TNF-α參與COPD的發病機制及炎癥反應過程。INF-γ為調節細胞功能的小分子多肽，主要由CD4+T細胞中Th1細胞產生，主要介導細胞免疫，可調節免疫網絡中其他細胞生物活性，對機體免疫反應的啟動、表現及免疫反應強弱起重要作用。研究表明[8]，INF-γ可激活血管內皮細胞，促進炎癥細胞滲出；INF-γ還可刺激單核巨噬細胞分泌細胞因子，繼而激活中性粒細胞，促進炎癥介質及炎性蛋白釋放，進而參與炎癥反應過程。國外研究發現[7]，INF-γ可調節細胞趨化因子表達，誘導MMP-12產生，抑制分泌型蛋白酶抑制劑產生，繼而促進COPD氣道炎癥。本研究結果表明，模型組血清、肺組織INF-γ水平顯著較對照組高，血清、肺組織中TNF-α水平及INF-γ水平均與氣道阻力呈正相關。可見TNF-α和INF-γ為COPD發病過程中的重要促炎因子，是引起氣道受阻的關鍵之一。

IL-10是一種重要抑炎因子，可對中性粒細胞、肺泡巨噬細胞分泌炎癥因子產生抑制作用，尤其是抑制IL-1、IL-6及TNF-α等細胞因子，繼而抑制氣道炎癥反應。有關其抑制炎癥因子機制尚不明確，目前初步認為該抑制作用主要發生于mRNA轉錄和翻譯水平，且在吸煙人群及COPD患者痰液中IL-10表達均下降。根據以上數據可以看出，模型組大鼠血清和肺組織中的IL-10水平明顯低于對照組，且經相關性分析，IL-10水平與氣道阻力呈負相關性。與張曉軍等[9]研究結果相似。故初步認為，在COPD自然病程中，IL-10的下調可加重炎癥，促使氣道重構[10]。

綜上所述，TNF-α和INF-γ作為重要的促炎因子，通過其在體內表達情況可間接反應COPD疾病進展情況。IL-10為重要的抗炎因子，在COPD呼吸道炎癥反應機制中起保護作用。故臨床可通過監測、調控IL-10表達，作為COPD患者氣道炎癥反應臨床防治的新思路。