柳枝稷PvbZIP8基因的克隆與表達分析

王偉偉， 王勇鋒， 張舒夢， 王竹林， 孫風麗， 張 超， 奚亞軍

(西北農林科技大學農學院， 陜西 楊凌 712100)

轉錄因子(transcription factors,TFs)在植物響應逆境脅迫中具有重要的作用，它能夠激活或者抑制下游基因的轉錄，使植物適應或抵御外界環境的變化[1]。近年來，AP2/ERE、NAC、MYB、WRKY和bZIP等轉錄因子在植物逆境響應中被廣泛研究。其中，bZIP轉錄因子是真核生物轉錄因子中分布最廣泛、最保守的轉錄因子之一，在人、動物、植物、微生物和昆蟲中均有發現[2]。bZIP的家族命名來源于成員蛋白序列共有的保守bZIP結構域，其結構域大約有60～80個氨基酸殘基，由一個堿性氨基酸區和一個亮氨酸拉鏈組成[3]。bZIP轉錄因子不僅參與調控植物的生長發育過程，還參與調控植物抵抗高鹽、干旱和寒冷等惡劣的自然環境[4]，比如bZIP家族中的ABI5蛋白是ABA抑制種子萌發和幼苗生長過程中的重要信號組分，受ABA、干旱和高鹽脅迫誘導表達，能提高植物對外源ABA的敏感性，在干旱條件下參與靶基因的轉錄調控[5]。S亞家族在擬南芥中是最大的bZIP亞家族，其中AtbZIP11/ATB2在高碳水化合物組織和維管束中被光上調表達，并且參與蔗糖轉錄后抑制調控[6]；AtbZIP1,AtbZIP2,AtbZIP44和AtbZIP53可能參與平衡碳水化合物的需求和供應[7]。同時，單子葉植物和雙子葉植物的數據表明bZIP轉錄因子S亞家族同源蛋白在脅迫處理后被轉錄激活[8]。在水稻中發現，S亞家族成員OsbZIP16參與ABA信號傳導途徑，過表達轉基因植株表現出顯著的抗旱性[9]；OsbZIP71在ABA介導的干旱和鹽耐受性中發揮重要作用[10]。

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)屬于禾本科(Gramineae)黍屬(Panicum)，是一種多年生C4高大草本植物，具有適應性強、生長速度快、生物量潛力大、對環境友好等多種優點[11-12]。作為不與糧爭地的模式能源植物，柳枝稷通常被種植在邊際土地[13]，因此往往遭受著干旱、洪澇、鹽漬、貧瘠等多種非生物逆境脅迫，顯著影響植物的生長發育。目前，關于柳枝稷基因功能鑒定方面的研究較少，尋找響應抗逆性相關的基因對柳枝稷的生長發育具有重要意義[14-16]。本研究通過對水稻OsbZIP16基因進行同源克隆獲得柳枝稷PvbZIP8基因，隨后對PvbZIP8基因進行了相關的生物信息學分析、非生物脅迫下的表達模式分析以及組織特異性表達分析，以期為柳枝稷的抗逆生物學研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

柳枝稷材料為四倍體低地型‘Alamo’品種，由西北農林科技大學小麥柳枝稷遺傳改良研究團隊提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料培養與處理 將柳枝稷種子置于培養皿中發芽，7 d后轉移柳枝稷幼苗到水培培養液中，置于16 h光照/28℃和8 h黑暗/20℃的培養箱中生長。生長36 d后取長勢一致的柳枝稷用于不同的非生物脅迫處理。

試驗進行的脅迫處理包括鹽、干旱、高溫和低溫脅迫，分別將柳枝稷置于20%的PEG6000，250 mM的NaCl,16 h光照38℃/8 h黑暗30℃和低溫4℃下，之后在不同的時間點(0，2，6和12 h)取樣，以0 h處理的樣品為對照，每個處理選取10株柳枝稷的葉片組織，混合后用錫紙包裹，迅速放入液氮中冷凍，之后用自封袋包裹放入—80℃超低溫冰箱中保存。

用于組織特異性表達分析的柳枝稷材料取自于西北農林科技大學試驗地(108°4′26″ E，34°17′49″ N)，取材日期是2018年5-10月，選取的組織或器官分別為營養生長時期的根、莖、葉、節和葉鞘以及生殖生長時期的小穗和種子[17]，材料保存在-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2.2 柳枝稷總RNA的提取和cDNA的合成 利用TRIZOL法提取植物組織的總RNA，利用反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara,Dalian,China)進行cDNA的合成。

1.2.3PvbZIP8基因的克隆 通過JGI數據庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)獲取柳枝稷PvbZIP8基因的序列[18]，利用Primer 6軟件設計上游引物(5′- AACCACTGCTTGTTTCCTTCTAC-3′)和下游引物(5′- CGATTGTGCCGATTCATATTAGTTG-3′)，以柳枝稷cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增體系為：稀釋后的cDNA 3 μl，2 × Phanta Max Buffer 25 μl，10 mM的dNTP Mix 1 μl，10 μM的上下游引物各1 μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μl，ddH2O 18 μl。擴增程序為：95℃預變性3 min，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸40 s，共進行34個循環，最后72℃徹底延伸5 min，4℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，用DNA純化回收試劑盒回收目的片段，回收產物平末端加A后連接到PMD18-T克隆載體，重組質粒轉化大腸桿菌DH5α，利用通用引物M13進行菌落PCR驗證，并將陽性克隆進行測序鑒定。

1.2.4 序列生物信息學分析 利用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找目的基因的開放閱讀框，ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)分析相應蛋白的理化性質[19]，SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析該蛋白的二級結構[20]，TMHMM2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析該蛋白的跨膜結構域[21]，利用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測該蛋白是否含有信號肽位點[22]，ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)對該蛋白的進行疏水性分析[19]，Psort Prediction (https://www.psort.org/)預測該蛋白的亞細胞定位[23]，NCBI-CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析該蛋白的保守結構域[24]，利用NCBI-Blastp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索目的蛋白的同源序列，之后在Clustalx2.1軟件中進行多序列比對并利用MEGA5.05軟件構建系統發育樹(Neighbor-joining tree,bootstrap設定初始值為1000次)[25,26]，最后運用MEME (http://meme-suite.org/tools/meme) 在線程序對PvbZIP8基因進行保守MOTIF分析[27]。

1.2.5 基因表達模式分析 分別以柳枝稷的根、莖、葉、節、葉鞘、小穗、種子和鹽、干旱、高溫、低溫脅迫處理后的葉片cDNA為模板，本試驗設計三個生物學重復。根據目的基因測序序列的保守區設計熒光定量PCR引物，上游引物和下游引物分別是F(5′-CTGGGACAGCAGACAAGCAAGAG-3′)和R(5′- CCACTTCCATCTCATTGAGCCTT-3′)。選擇Elongation Factor 1-α作為內參基因[28]，其引物序列分別是PvEF-1-alphaF(5′-CCAAGAGGCCTTCAGACAAG -3′)和PvEF-1-alphaR(5′- TGAGATCCTTCACAGCAACG-3′)。之后通過QuantStudio 5定量PCR儀(Thermo Fisher，MA，USA)使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Takara,Dalian,China)試劑進行qRT-PCR反應。反應體系按照說明書進行(Takara,Dalian,China)，反應程序按以下步驟進行：95℃下10 min；95℃下5 s，60℃下31 s，共進行40個循環。反應結束后通過2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量[29]，分別檢測目的基因在柳枝稷不同組織或器官及不同脅迫處理下的表達情況，并通過IBM SPSS Statistics 22.0進行顯著性分析(P<0.05)，隨后利用Microsoft Excel繪制柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 PvbZIP8基因克隆和保守結構域分析

通過柳枝稷基因組數據庫獲得PvbZIP8的cDNA基因序列，隨后設計此基因的特異性擴增引物，經PCR擴增獲得650 bp的特異性目的條帶(圖1)，測序分析后確認該序列為柳枝稷PvbZIP8基因，其含有468 bp開放閱讀框，編碼155個氨基酸(圖2)。通過NCBI-CDD網站分析此基因具有完整的bZIP結構域(圖3)，屬于bZIP轉錄因子家族成員。通過NCBI-blastp比對發現此基因與哈氏黍bZIP8蛋白序列相似度達91%，故將其命名為PvbZIP8。

圖1 柳枝稷PvbZIP8基因PCR擴增產物Fig.1 PCR amplification products of switchgrass PvbZIP8注：M．DL2000;1. PvbZIP8擴增片段Note:M．DL2000;1. products of PvbZIP8

2.2 PvbZIP8蛋白理化性質分析

利用ProtParam在線程序對PvbZIP8的蛋白質序列進行理化性質分析，分析結果表明，PvbZIP8基因翻譯的蛋白質分子量為17.81 kDa，分子式是C761H1248N24O23S8，等電點是9.15。蛋白中含量較高的包括12.3%的亮氨酸、11.6%的精氨酸、8.4%的絲氨酸和8.4%的丙氨酸；Asp + Glu為21，Arg + Lys為25，屬于堿性蛋白質，不穩定系數是61.96，屬于不穩定蛋白，總平均親水性GRAVY值是-0.669，為親水性蛋白。

此外，二級結構預測顯示該蛋白主要包括α螺旋(Alpha helix,67.10%)、無規則卷曲(Random coil,25.81%)、延伸鏈(Extended strand,4.52%)和β轉角(Beta turn,2.58%)(圖4)。對柳枝稷PvbZIP8蛋白跨膜結構和信號肽進行預測分析發現，PvbZIP8不包含跨膜蛋白和信號肽位點；亞細胞定位預測顯示PvbZIP8蛋白主要定位于細胞核內；利用ProtScale對柳枝稷PvbZIP8蛋白進行疏水性分析發現，該蛋白堿性氨基酸區具有親水性，亮氨酸拉鏈區具有疏水性。

圖2 PvbZIP8基因ORF序列及氨基酸序列Fig.2 ORF sequence and amino acid sequence of PvbZIP8

圖3 PvbZIP8蛋白的功能結構域Fig.3 The conserved domain of the PvbZIP8 protein

圖4 PvbZIP8蛋白的二級結構Fig.4 Predicted secondary structure for PvbZIP8 protein

2.3 PvbZIP8同源比較和系統進化分析

利用NCBI-blastp程序分析柳枝稷PvbZIP8基因與其它近源物種的蛋白同源性。結果表明，PvbZIP8蛋白的氨基酸序列與哈氏黍(Panicumhallii,XP_025825344.1)、谷子(Setariaitalica,XP_014660928.1)、玉米(Zeamays,XP_008645357.1)、糜子(Panicummiliaceum,RLM79681.1)和高粱(Sorghumbicolor,XP_002453452.1) 的相似性分別為91%、89%、68%、67%和65%。根據多序列比對分析(圖5)，柳枝稷PvbZIP8蛋白與其它物種有相似的結構特征，都含有保守的bZIP(堿性亮氨酸拉鏈)結構域，由一個堿性氨基酸區和一個亮氨酸拉鏈組成。利用MEGA5.05對同源性較高的物種構建系統進化樹(圖6)，發現柳枝稷PvbZIP8與哈氏黍親緣關系最近，其次是谷子和糜子；隨后通過MEME程序對這些物種中的同源序列進行模體分析，結果表明這些蛋白都含有保守的Motif 1和Motif 6，均位于bZIP保守結構域(圖6)。

圖5 PvbZIP8蛋白與其它物種同源序列的多重比對Fig.5 Multiple alignment of PvbZIP8 protein with homologous sequences of other species

圖6 PvbZIP8與其它物種同源序列的系統進化樹及蛋白保守結構域Fig.6 Phylogenetic tree and protein conserved domain of PvbZIP8 homologous sequences among species注(note)：哈氏黍，Panicum hallii (XP_025825344.1)；谷子，Setaria italica (XP_014660928.1)；糜子，Panicum miliaceum (RLM79681.1)；高粱，Sorghum bicolor (XP_002453452.1)；玉米，Zea mays (XP_008645357.1)；水稻，Oryza sativa (EAY84825.1)；青蒿，Artemisia annua (PWA89386.1)；菜豆，Phaseolus vulgaris (XP_007157937.1)；三葉草，Trifolium subterraneum (GAU21676.1)

2.4 PvbZIP8基因在非生物脅迫下的表達模式分析

在鹽、干旱、高溫和低溫脅迫下，柳枝稷PvbZIP8基因表達量發生明顯變化(圖7)。其中在鹽、高溫和低溫脅迫處理6 h，PvbZIP8的表達量上升到最大值，分別是對照組的37，58和8倍，隨后表達量在12 h開始下降；在干旱脅迫處理2 h后，PvbZIP8被迅速誘導達到最大值，達到對照組的8倍。

圖7 PvbZIP8在多種非生物脅迫下的表達量分析Fig.7 Analysis of the expression level of PvbZIP8 under various abiotic stresses

2.5 PvbZIP8基因在不同組織或器官下的表達模式分析

利用qRT-PCR技術，對柳枝稷根、莖、葉、節、葉鞘、小穗和種子的表達水平進行定量分析，結果表明PvbZIP8基因在多個組織或器官中均有表達，其中在根、莖和葉中表達量較高，在節、葉鞘、小穗和種子中表達量較低，在葉片中表達量最高，約是表達量最低的節中的4倍(圖8)。

圖8 PvbZIP8在不同組織或器官的表達量分析Fig.8 Analysis of the expression of PvbZIP8 in different tissues or organs

3 結論與討論

bZIP轉錄因子是最大、保守性最高的轉錄因子家族之一，bZIP蛋白由堿性氨基酸區和亮氨酸拉鏈區組成，堿性氨基酸區包含與特異的DNA序列發生作用的核定位信號和DNA結合結構域，亮氨酸拉鏈區是由多個重復七肽組成。bZIP轉錄因子家族已經在擬南芥[30]、水稻[31]、玉米[32]、高粱[33]和大豆[34]等多個物種中進行了詳細的鑒定和分析，前期研究中表明，bZIP轉錄因子家族參與植物生長、種子成熟和非生物脅迫等多種生物學進程[30]。基于bZIP家轉錄因子在植物抗逆過程中的重要性，本研究通過克隆得到柳枝稷PvbZIP8基因，并對其進行相關的生物信息學分析和基因表達分析。研究結果表明，柳枝稷PvbZIP8基因編碼155個氨基酸，屬于堿性親水性蛋白質，不包含跨膜蛋白和信號肽位點。該基因預測定位在細胞核內，這與水稻中同源基因OsbZIP16結果相同[9]，可能具有反式激活活性。柳枝稷PvbZIP8基因與近源單子葉植物哈氏黍、谷子和糜子的同源序列相似度分別達到了91%，89%和91%，表明該基因在進化過程中具有較高的保守型，并且具有典型的堿性氨基酸區N-X7-R/K和亮氨酸拉鏈區，屬于bZIP轉錄因子家族成員之一。

系統進化分析表明，柳枝稷PvbZIP8與哈氏黍親緣關系最近，其次是谷子和糜子；在線程序MEME結果顯示哈氏黍、谷子和糜子具有相同的保守結構域，二者之間相互印證，進一步說明PvbZIP8在進化過程中的保守型，以此推測該基因在植物中發揮重要的功能。在水稻中bZIP轉錄因子家族被分成10個亞家族，不同的亞家族具有不同的結構和功能特點，A亞家族中的基因大多數響應ABA信號途徑[31]。通過與水稻bZIP家族基因進行同源比對，柳枝稷PvbZIP8基因被定位在S亞家族，S亞家族被認為與干旱、冷和傷害等非生物脅迫相關。例如水稻OsbZIP16在可以正向調控水稻的抗旱性，在干旱情況下OsbZIP16的表達量被顯著誘導，過表達OsbZIP16的轉基因水稻植株表現出顯著的抗旱性[9]。本實驗通過qPCR發現，柳枝稷PvbZIP8響應鹽、干旱、高溫和低溫等多種非生物脅迫，在不同處理時間PvbZIP8基因轉錄水平發生明顯上調，表明該基因在柳枝稷中響應多種非生物脅迫，對柳枝稷的抗逆耐受性具有重要意義，并且該基因在抗旱性中的表現與水稻OsbZIP16基因相一致。在組織特異性表達分析發現，柳枝稷PvbZIP8基因在根、莖和葉中表達水平明顯高于其在種子、小穗、葉鞘和節中的表達，并且在葉片中表達水平最高，暗示該基因在營養生長階段發揮相對重要的作用，具有明顯的時空特異性表達特點。

目前，關于柳枝稷基因功能鑒定在bZIP家族中尚未報道，本研究通過對PvbZIP8轉錄因子進行克隆和表達分析，初步確定該基因在非生物脅迫中發揮重要作用，將為進一步研究柳枝稷PvbZIP8基因的生物學功能奠定基礎，并為柳枝稷中其它基因的研究提供重要參考意義。