鹽堿脅迫下紫花苜蓿葉片蛋白組的初步分析

李 波， 方志堅， 鄔婷婷， 李 紅，楊 曌， 趙宇佳

(1.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院， 黑龍江 齊齊哈爾 161005)

土地鹽堿化是非常重要的非生物脅迫，嚴重影響作物的生產和農業生產力[1]。土壤鹽漬化問題在世界范圍內廣泛存在，已成為制約農業發展的主要因素之一[2]。高濃度鹽堿會導致植物體缺水，對植株有一定的離子毒害作用，嚴重的會導致植株的死亡。在當今日益稀缺的土地資源中，鹽堿地的改良利用已成為全球科研界研究的熱點和難點之一[3]。近年來，以耐鹽植物改善鹽堿土壤的技術逐漸受到關注。紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種重要的多年生豆科牧草[4]，除作為飼料牧草外，還可以用作綠肥使用[5]。因其葉片具有排鹽機制，是一種耐鹽性較強的牧草[6]。

蛋白質是生命活動的物質基礎，是細胞生理功能的執行者，多個蛋白質通過協同作用來應對細胞的一系列生理生化的變化[7]。而植物的耐鹽機理與多種大分子密切相關，是一個復雜的反應過程[8]。同位素相對標記與絕對定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantization，iTRAQ)技術是在2004年推出的一種通過對氨基酸N端及賴氨酸殘基酶解并用同位素標記的技術。該技術的原理是采用同重同位素標簽進行肽段標記，可同時對多達4(或8)種蛋白樣品進行相對或絕對定量及差異蛋白功能的生物信息學分析的蛋白質測定技術[9]。隨著現代分子生物學的不斷發展，iTRAQ技術因其具有高定量精度的特點而在蛋白組學中應用廣泛[10]。近年來，不斷完善的蛋白組學技術在紫花苜蓿的耐鹽分子機制研究也受到重視，裴翠明[11]等發現了417個差異蛋白參與苜蓿幼苗葉片耐NaCl脅迫；馬進[12]等人發現有534個差異蛋白響應鹽脅迫。本研究利用iTRAQ技術從分子水平上研究紫花苜蓿葉片抗鹽堿機理，篩選響應鹽堿脅迫的差異表達蛋白，對差異表達蛋白進行GO注釋和KEGG注釋，分析在鹽堿脅迫下紫花苜蓿葉片差異表達蛋白具體的代謝途徑，發掘抗鹽堿的應答機制，對鹽堿地的改良、苜蓿耐鹽植株的篩選和植物抗鹽堿功能蛋白的發掘具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用由黑龍江省畜牧研究所提供的紫花苜蓿WL343HQ種子為試驗材料。本實驗Hoagland培養液所用的無機鹽均購自天津市凱通化學試劑有限公司，RNA采用TRIZOL方法進行提取(Cheng D)，RNA反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自寶日醫生物技術(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗材料及處理 挑選籽粒飽滿的WL343HQ紫花苜蓿種子，用1% HgCl2消毒10 min，40℃溫水浸泡2 h，用無菌水清洗3次將包衣清洗干凈，播種到塑料花盆中，每盆播種50粒。待其幼苗長到三葉一心期，將長勢一致的紫花苜蓿幼苗取出用清水反復清洗根部，置入稀釋一倍的改良霍格蘭營養液預培養3 d。將幼苗分為兩組，對照組(WL-CK)用無菌水培養72 h,實驗組(WL-EG)用150 mmol/L的NaHCO3，Na2CO3摩爾比為9∶1的混合溶液脅迫72 h。選取葉片大小相近的2組紫花苜蓿葉片混合，—80 ℃冷凍保存。培養條件，光照16 h，黑暗8 h，生長溫度25℃。

1.2.2 蛋白提取、酶解與iTRAQ標記 采用丙酮沉淀法提取對照和鹽堿脅迫苜蓿葉片蛋白，取WH-CK和WH-EG兩個樣本各0.1 g加到機械拋光(Mechanically Polished,MP)粉碎管中，各管中加入600 μl裂解液，冰上裂解10min，MP震蕩儀震蕩后冰上裂解15 min，高速冷凍離心機20 000 g，4℃離心20 min，取上清。利用BCA法測定蛋白質的濃度，用SDS-PAGE法對蛋白質進行檢測，取100 μg樣品加入裂解液補充體積到100 μL，加50 mM DTT，37℃反應30 min，再加入10 mM碘乙酰胺室溫避光反應30 min，加入丙酮—20℃沉淀2 h后10 000 rpm·min-1離心20 min，取沉淀加入100 μL 100 Mm TEAB充分溶解，按照質量比 1∶50(酶∶蛋白)加入Trypsin在 37℃酶解過夜。用iTRAQ 8-113和iTRAQ 8-115分別標記無菌水培養和150 mmol·L-1的NaHCO3，Na2CO3混合脅迫培養的葉片蛋白，等量混合后利用C18反相柱對肽段進行預分離，聯合LPC-MS-MS進行分析。

1.2.3 差異蛋白功能分析 使用Protein Discoverer TM Software 2.1軟件鑒定蛋白質，與uniprot-Medicago truncatula-3880.fasta數據庫進行比對，利用Goatools(http:github.com/tanghaiban/Goatools)軟件對差異蛋白進行顯著性富集分析，當蛋白豐度差異倍數大于1.2倍或小于0.83倍且P值小于0.05視為不同樣品間的差異蛋白，結合KEGG數據庫對差異蛋白進行功能分析。

1.2.4 qRT-PCR數據驗證 隨機選取8個差異表達基因用于實時熒光定量PCR。提取對照組(WL-CK)與實驗組(WL-EG)的葉片RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉錄成cDNA，以EF-α基因作為內參，設置三組平行計算基因的相對表達水平。

表1 蘇打鹽堿脅迫條件下紫花苜蓿8個差異表達基因qRT-PCR引物Table 1 Primers of eight differentially expressed genes used for quantitative real-time PCR in alfalfa under salt-alkali stress

2 結果

2.1 蛋白質鑒定基本信息

為從分子水平上揭示紫花苜蓿的耐鹽機理，利用iTRAQ技術對經混合鹽堿脅迫處理后的紫花苜蓿葉片蛋白質組進行差異性分析，其中鑒定151 683個二級圖譜，匹配到圖譜數為52 760個；共鑒定到肽段數為12 373條，蛋白質有6 435個，差異蛋白有3 178個，篩選統計共有318個差異表達蛋白，其中上調蛋白172個，下調蛋白146個。

2.2 差異蛋白GO注釋

GO注釋使基因分為3個本體，分別為生物過程(Biological Process)，細胞組分(Cellular Component)和分子功能(Molecular Function)。這些蛋白質涉及17個生物過程：其中代謝過程(metabolic process)占53.14%(up 91，down 78)，單一生物過程(single-organism process)占30.19%(up 53，down 43)，細胞過程(cellular process)占34.91%(up 44，down 67)，刺激響應(response to stimulus)占9.43%(up 17，down 13)，生物調節(biological regulation)占7.86%(up 9，down 16)，細胞定位過程(establishment of localization)占5.66%(up 8，down 10)；參與14個細胞組分，其中細胞(cell)占26.73%(up 33，down 52)，細胞組分(cell part)占26.42%(up 32，down 52)，細胞器(organelle)占19.18%(up 25，down 36)，細胞膜成分(membrane part)占18.55%(up 24，down 35)，復雜大分子(macromolecular complex)占12.58%(up 17，down 23)；包含9個分子功能，其中催化活性(catalytic activity)占46.54%(up 93，down 55)，結合(binding)占39.31%(up 58，down 67)，抗氧化活性(antioxidant activity)占3.14%(up 8，down 2)，結構性分子活性(structural molecular activity)占2.52%(up 7，down 1)，轉運活性(transporter activity)占2.83%(up 5，down 4)，電子載體活性(electron carrier activity)占2.20%(up 3，down 4)。結果如圖1所示。

2.3 差異蛋白GO富集

通過GO富集發現，差異蛋白富集在生物過程的有細胞對化學刺激的反應(cellular response to chemical stimulus，11)，活性氧代謝過程(reactive oxygen species metabolic process,10)，細胞對氧化應激的反應(cellular response to oxidative stress,9)，細胞對活性氧的反應(cellular response to reactive oxygen species,9)，細胞對含氧化合物的反應(cellular response to oxygen-containing compound,10)，光合作用(photosynthesis,19)，對活性氧的反應(response to reactive oxygen species，9)，細胞對刺激的反應(cellular response to stimulus，20)，蛋白質-發色團連接(protein-chromophore linkage，8)，細胞對壓力的反應(cellular response to stress，10)，光合作用，光捕獲(photosynthesis,light harvesting，6)，細胞對過氧化氫的反應(cellular response to hydrogen peroxide，6)，過氧化氫分解代謝過程(hydrogen peroxide catabolic process，6)，過氧化氫代謝過程(hydrogen peroxide metabolic process，6)，應對壓力(response to stress，23)，對過氧化氫的反應(response to hydrogen peroxide，6)，對無機物質的反應(response to inorganic substance，9)，防御響應(defense response，8)，對氧化應激的反應(response to oxidative stress，10)，對含氧化合物的反應(response to oxygen-containing compound，10)，細胞對氧自由基的反應(cellular response to oxygen radical，3)，對氧自由基的反應(response to oxygen radical，3)，對超氧化物的反應(response to superoxide，3)，超氧代謝過程(superoxide metabolic process，3)，去除超氧自由基(removal of superoxide radicals，3)，細胞對超氧化物的反應(cellular response to superoxide，3)，植物型細胞壁組織(plant-type cell wall organization，2)，對刺激的反應(response to stimulus，30)和對生物刺激的反應(response to biotic stimulus，6)；細胞組分包括光合作用(photosystem，16)和光系統I(photosystem I，10)；分子功能包括四吡咯結合(tetrapyrrole binding，21)，葉綠素結合(chlorophyll binding，9)，血紅素結合(heme binding，12)，金屬離子結合(metal ion binding，56)，陽離子結合(cation binding，56)，超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase activity，3)，作為受體作用于超氧自由基氧化還原酶活性(oxidoreductase activity,acting on superoxide radicals as acceptor，3)，鐵離子結合(iron ion binding，9)，抗氧化活性(antioxidant activity，10)，甲酰四氫葉酸脫甲酰酶活性(formyltetrahydrofolate deformylase activity，2)，O-甲基轉移酶活性(O-methyltransferase activity，3)，作用于碳水化合物和衍生物的消旋酶和差向異構酶活性(racemase and epimerase activity,acting on carbohydrates and derivatives，3)，核酮糖-二磷酸羧化酶活性(ribulose-bisphosphate carboxylase activity，3)，半胱氨酸型肽酶活性(cysteine-type peptidase activity，3)，序列特異性DNA結合轉錄因子活性(sequence-specific DNA binding transcription factor activity，2)，核酸結合轉錄因子活性(nucleic acid binding transcription factor activity，2)，過氧化物酶活性(peroxidase activity，7)，消旋酶和差向異構酶活性(racemase and epimerase activity，3)，作為受體作用于過氧化物的氧化還原酶活性(oxidoreductase activity,acting on peroxide as acceptor，7)，羧酸結合(carboxylic acid binding，4)和有機酸結合(organic acid binding，4)。結果如圖2所示。

圖1 蘇打鹽堿脅迫紫花苜蓿葉片組織上調和下調蛋白質GO注釋Fig.1 GO annotation of up-regulated and down-regulated protein in alfalfa leaf tissue under soda salt-alkali stress

圖2 蘇打鹽堿脅迫紫花苜蓿葉片差異蛋白GO富集Fig.2 GO enrichment of alfalfa leaf differential protein under soda salt-alkali stress

2.4 差異蛋白Pathway富集

通過Pathway富集發現，53.46%差異蛋白共參與76條代謝通路中，具有顯著性差異(P<0.05)的代謝途徑包括光合作用途徑(3.18%，10)(Photosynthesis)，苯丙素生物合成途徑(2.83%，9)(Phenylpropanoid biosynthesis)，苯丙氨酸代謝途徑(2.52%，8)(Phenylalanine metabolism)和類黃酮生物合成途徑(0.94%，3)(Flavonoid biosynthesis)，結果如表2所示。

表2 紫花苜蓿鹽堿脅迫下差異蛋白Pathway富集信息Table 2 Pathway enrichment information of alfalfa differential proteins under salt-alkali stress

2.5 差異表達基因qRT-PCR驗證

隨機選取8個差異表達基因，以EF-α為內參進行qRT-PCR驗證，其中包含6個上調表達基因(c55183_g1，c65586_g1，c68420_g4，c54763_g1，c66291_g3，c48910_g1)和2個下調表達基因(c59095_g1，c70714_g3)。結果如表3所示。

表3 鹽堿脅迫處理紫花苜蓿差異表達基因qRT-PCR驗證Table 3 qRT-PCR verification of differentially expressed genes in alfalfa under salt-alkali stress

3 討論

全球鹽堿地土壤面積在不斷擴大，對農業生產力產生重大影響，鹽堿脅迫會導致植物組織損傷，甚至是整個機體的紊亂，所有的這些變化均可以在蛋白組學中進一步得到體現。在本研究中，我們主要描述耐壓苜蓿植物對鹽堿的反應，以識別與壓力相關的蛋白質，并了解應激適應的可能機制。蛋白質在參與應激反應的過程中不是單獨執行功能的，而是與其他蛋白質之間相互作用來實現應答過程[13]。通過Pathway富集分析發現，在鹽堿脅迫處理下紫花苜蓿葉片組織差異表達蛋白主要參與光合作用途徑、苯丙素生物合成途徑、苯丙氨酸代謝途徑和類黃酮生物合成代謝途徑等。

光合作用途徑中的氧化磷酸化過程在植物體中起重要的作用。在鹽堿脅迫處理下，植物體的光合作用最先受到影響。光合作用是植物生長發育所需能量的來源，而氧化磷酸化能夠將光合作用合成的碳水化合物氧化時釋放的能量提供給ADP，進而通過偶聯反應合成ATP[14]。能量的儲存與釋放，使植物體的生長發育得以進行。鹽堿脅迫對光合作用的影響既可以通過氣孔和葉肉的擴散來限制光合代謝過程，也可以是由多重脅迫疊加產生的氧化脅迫進行抑制[15]。本研究光合作用涉及的十種蛋白質中，葉綠素a/b結合蛋白、細胞色素c氧化酶、ATP合成酶受鹽堿脅迫顯著下調，這些蛋白與光反應密切相關。鹽堿脅迫可以抑制CO2的固定，使卡爾文循環中相應酶的活性降低，這些酶包括碳酸酐酶(CA)，磷酸核糖激酶(PRK)，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO)和鐵氧還蛋白-硫氧還蛋白還原酶(FTR)等[16]。CA可以提高葉綠體中CO2的濃度使RuBisCO的羧化速率加快[17]。參與光反應的下調蛋白質可以降低還原力、減少活性氧的產生，使紫花苜蓿在遭受鹽堿脅迫時擁有更活躍的光合作用能力和氧化磷酸化進程，從而加快植物體的新陳代謝，增強植物的耐鹽性。

苯丙素生物合成途徑是植物中重要的次級代謝產物的合成途徑，苯丙素類是具有生理活性的次級代謝產物，由苯丙氨酸代謝途徑衍生，在非生物和生物脅迫的反應中起作用[18]。苯丙是由氨基酸苯丙氨酸合成的次生代謝產物[19-20]，苯丙素生物合成途徑主要的終產物之一是木質素，木質素是酚類雜聚物，是植物細胞壁的主要結構組分，可提高機械強度，抵御逆境脅迫造成的傷害[21]。除了木質素之外，該途徑產生各種各樣的代謝物，執行生物體大量的生物功能[22]。研究表明，逆境脅迫下植物體內的苯丙素生物合成途徑被激活，苯丙氨酸氨基裂解酶的活性迅速上升。在苯丙氨酸代謝途徑中，過氧化物酶參與生物的合成，可催化氧化胺類、酚類和過氧化氫，從而降低植物體內的酚類和胺類化合物毒性，降低過氧化氫含量，從而減輕活性氧損害，提升植物的抗逆能力[23]。本研究中苯丙素生物合成和苯丙氨酸代謝涉及的十種蛋白質中，過氧化物酶、巢菜甙水解酶、咖啡酰-CoA O-甲基轉移酶、甘露醇脫氫酶和轉氨酶活性在鹽堿脅迫處理下顯著上調，提高植物抵御逆境脅迫的能力。

類黃酮是植物多酚次級代謝產物，類黃酮的主要分為花青素，黃酮醇，黃烷醇和原花色素(PA)，在不同植物種類的不同生長發育階段以化合物的形式廣泛分布[24]。它們具有廣泛的功能，如抗氧化活性，紫外線防護，防御植物病原體和生長素的調控等[25]。在許多植物中，類黃酮生物合成過程在應激脅迫中起關鍵作用。在鹽脅迫下，過表達AtROS1轉基因煙草編碼類黃酮生物合成和抗氧化途徑相關的酶表達較高，增加了對鹽脅迫的耐受性[26]。在大豆中根中，鹽脅迫加強了黃酮化合物的積累，黃酮類化合物可以在大豆對鹽脅迫的耐受性下游發揮重要作用，確定了三種查爾酮異構酶表達水平顯著增加[27]。海馬齒在響應鹽脅迫時，根和葉片中的黃酮類和糖脂協調反應，誘導高滲物，最大限度減少鹽誘導的損害[28]。本研究類黃酮生物合成途徑涉及的三種蛋白質中，查爾酮異構酶的表達顯著上調，使紫花苜蓿在應對逆境脅迫時啟動防御機制，從而防止植物受到氧化和離子脅迫。

4 結論

采用iTRAQ技術分析鹽堿脅迫下紫花苜蓿葉片中蛋白表達差異，篩選到172個上調蛋白和146個下調蛋白，通過GO注釋和KEGG注釋發現，這些差異蛋白的功能涉及光合作用途徑、苯丙素生物合成途徑、苯丙氨酸代謝途徑和類黃酮生物合成途徑。