氧濃度可控制小鼠飼養箱的研制

張紅兵，鄭 博，楊曉崗，馬廣強

作者單位:1(710002)中國陜西省西安市第一醫院眼科 陜西省眼科研究所;2(330004)中國江西省南昌市，江西中醫藥大學

0 引言

自從 1994年 Smith等［1］將早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)小鼠動物模型標準化以來，涌現出了許多以該模型為載體的ROP相關基礎研究，為深入認識和更好防治ROP起了很大推動作用［2－5］。在制作ROP小鼠模型時，如何保持新生小鼠穩定持續暴露在75%±2%的氧濃度是實驗成敗的關鍵，我們在實驗過程中自行研制了一種簡單實用的氧濃度可控制小鼠飼養箱(專利號:ZL 2010 2 0647695.X.)，效果顯著，性能穩定，現報告如下。

1 材料和方法

圖1 氧濃度可控制小鼠飼養箱模式圖。

圖2 氧濃度可控制小鼠飼養箱內面觀。

1.1 材料 數字顯示控氧儀(KY－2F型，常州恒隆儀器有限公司)、電磁閥(2W－025－08，中國德力西控股集團有限公司)、有機玻璃(5mm，西安久力恒亞克力制品有限公司)、有機玻璃粘合劑(三氯甲烷，湖南恒隆石油化工有限公司)、氧氣減壓器(YQY－342，上海減壓器廠)。

1.2 方法 (1)用玻璃膠粘合制作有機玻璃飼養箱，正面開口，供飼養小鼠的籠子出入，開口的周圍鑿旋轉螺絲孔，便于固定封口的密封蓋，側面有通風口，通風口處安裝一個閥門，控制通風口大小，平衡飼養箱內外壓力。(2)從頂部向飼養箱內接入KY－2F型數字顯示控氧儀的氧氣探頭和輸送氧氣的送氣管，送氣管由電磁閥控制。(3)連接測氧儀和電磁閥。(4)通過測氧儀上的參數設置按鈕，設定測氧儀正常范圍為74%～76%，當氧分壓低于74%時，測氧儀發出指令，報警器發出報警聲，同時電磁閥開放，開始向飼養箱里輸入氧氣，當氧分壓高于76%時，測氧儀發出指令，報警器發出報警聲，同時電磁閥關閉，停止輸入氧氣，最終維持氧分壓在 74%～76%(圖 1、2)。

1.2.1 鑒定方法 將出生第7d C57BL/6J小鼠連同母鼠以窩為單位分成兩組，每組6只，一組在正常環境中飼養10d，另一組放于高氧箱內連續飼養5d，再在正常環境中飼養5d。第17d每組3只新生小鼠用氯胺酮(60mg/kg，北京雙鶴藥業股份有限公司)和賽拉嗪(18mg/kg，吉林省方正動物藥業有限責任公司)麻醉新生小鼠，剪開左側肋骨，暴露心臟，向左心室內注射熒光素標記的高分子量右旋糖酐(50mg/mL，Sigma)，解剖出眼球，避光在4%多聚甲醛(博士德生物工程有限公司)固定24h后解剖出視網膜，平鋪固定在載玻片上，熒光顯微鏡觀察照相。第17d每組另外3只新生小鼠視網膜做HE染色，具體方法為新生小鼠麻醉后解剖出眼球(不暴露心臟)，4%多聚甲醛(博士德生物工程有限公司)固定24h后，石蠟包埋切片，HE染色觀察玻璃體腔視網膜新生血管生成情況。

圖3 視網膜分區模式圖(相鄰分區線的距離相同)。

圖4 正常新生小鼠第17d視網膜鋪片(結合熒光素的高分子量右旋糖酐心臟灌注):視網膜無灌注區和新生血管生成(×4)。

圖5 高氧條件下第17d新生小鼠視網膜鋪片(結合熒光素的高分子量右旋糖酐心臟灌注):視網膜血管大片無灌注區和新生血管生成(×4)。

1.2.2 視網膜新生血管量化 在高氧條件下，未發育成熟的新生小鼠視網膜，在血管化過程中生成了病理性新生血管、新生血管芽和新生血管突［6－8］。盡管這些新生血管芽和新生血管突可能分布不一致，但是如果將視網膜用不同半徑的同心圓分成四個區(以視盤為中心，分別以視盤到視網膜邊緣距離的1/4、2/4、3/4和4/4為半徑畫圓，將視網膜分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個區)，通過計數不同區的新生血管芽和新生血管突，可以反映氧誘導視網膜病變的嚴重程度［9］(圖 3)。

2 結果

2.1 視網膜鋪片 第17d正常環境中飼養的3只C57BL/6J新生小鼠視網膜大血管走形正常，無迂曲擴張，小血管分布均勻，無無灌注區和新生血管生成，而高氧組3只C57BL/6J新生小鼠視網膜大血管迂曲擴張，小血管分布不均勻，后極部視網膜大片無灌注區形成，周圍大量新生血管生成(圖 4、5)。

圖6 視網膜無灌注區與全部視網膜面積的比值:正常氧條件下新生小鼠視網膜無無灌注區形成，而高氧條件下新生小鼠視網膜無灌注區面積為33.07%。

圖7 視網膜新生血管突在視網膜不同區域的分布:正常氧條件下新生小鼠視網膜沒有新生血管突生成，而高氧條件下新生小鼠視網膜大量新生血管突生成，且主要位于II和III區。

圖8 視網膜新生血管叢在視網膜不同區域的分布:正常氧條件下新生小鼠視網膜沒有新生血管叢生成，而高氧條件下新生小鼠視網膜大量新生血管叢生成，且主要位于II和III區。

2.2 視網膜新生血管量化分析 正常C57BL/6J新生小鼠在第17d已經完成視網膜血管化，無無灌注區、視網膜新生血管突和新生血管叢生成，而經過高氧環境誘導的C57BL/6J新生小鼠，第17d視網膜中央大片無灌注區生成(33.07%)，并有新生血管突和新生血管叢生成，且主要聚集在Ⅱ區(40.27%)和Ⅲ區(44.97%)，而Ⅰ區(4.36%)和Ⅳ區(10.40%)較少(圖6～8)。

2.3 視網膜切片比較 正常環境中飼養的3只C57BL/6J新生小鼠，第17d視網膜結構規整，內界膜完整，神經節細胞層為單層細胞結構，主要由神經節細胞核組成，血管結構可見，但是少且排列整齊(圖9);飼養箱內高氧誘導的C57BL/6J新生小鼠，第17d視網膜神經纖維層結構紊亂，內界膜不完整，為長入的新生血管破壞，部分增生的血管內皮細胞長入玻璃體腔，形成管腔樣結構，由于血管內皮等細胞的增生，單層的細胞結構變為多層，并且排列不規則(圖10)。

3 討論

圖9 正常新生小鼠第17d視網膜HE染色:視網膜內界膜完整，沒有新生血管長入(×100)。

圖10 高氧誘導后第17d新生小鼠視網膜，視網膜內界膜不規整，新生血管突視網膜內界膜規整，無新生血管突破(HE染色×100)。

目前國內從事ROP基礎研究很多，制作該動物模型時建立高氧環境常有以下幾種方法:(1)給小鼠飼養箱內間斷人工充氧，用測氧儀間斷測定飼養箱內氧濃度;(2)用高壓氧艙飼養小鼠;(3)購置進口控氧儀(PRO－OX 110 chamber oxygen controller，Biospherix Ltd，Redfield，NY)。這些方法存在很多現實問題，測氧儀間斷測量飼養箱內氧濃度，很難保持飼養箱內氧濃度穩定，費時費力，還容易影響實驗結果穩定性;進口控氧儀控氧性好，但是價格昂貴，一般研究人員很難有充足的實驗經費購買這種設備;高壓氧艙控氧效果理想，但是專門為動物實驗購買這種昂貴儀器的可能性更小，同時維持儀器正常運轉的費用高昂，專門借用可能性也不大?；谏鲜鲈?，研制氧濃度可控性好、價格實惠的小鼠飼養箱，對成功制作ROP動物模型具有明顯實用價值。

KY－2F數字顯示控氧儀由氧電極、放大器、模擬比較器和報警器四部分組成，其中氧電極以鉑金為陰極，氯化銀為陽極，并以聚四氟乙烯為滲透隔離膜，氣體中的氧氣可以透過薄膜到達陰極，在650mV的極化電壓下發生化學反應，并快速達到平衡，同時產生一個極限擴散電流，此電流大小與氣體中的氧分壓成正比，因此可以感受周圍環境中的氧分壓變化。產生的電流一部分通過顯示屏，顯示所測氣體的氧氣含量，另一部分通過模擬比較器推動繼電器，當氧氣含量超過設定值時儀器發出聲光報警，同時向電磁閥輸出電流。

電磁閥是利用電磁感應原理，控制閥門開啟或關閉的自動化基礎元件，在本研究中，它可以調整氧氣瓶向飼養箱里輸送氧氣的流量和速度，當數字控氧儀產生的電流流入電磁閥里面的線圈時，由于電磁感應產生電磁力，當電磁力大于電磁閥里彈簧對動鐵芯的阻力時，動鐵芯克服彈力，和靜鐵芯直接吸和，閥門被打開，氧氣進入氧箱，當數字控氧儀沒有電流流入電磁閥線圈時，線圈不能產生電磁力，動鐵芯在彈簧的彈力作用下離開靜鐵芯，閥門關閉，氧氣不再進入飼養箱。

有機玻璃飼養箱是根據有機玻璃對氣體壓力耐受程度和便于觀察而采用的，并參考小鼠飼養籠的尺寸設計飼養箱的體積、出入口和通風口，最后用有機玻璃膠粘合而成。有機玻璃飼養箱接口密封處無氧氣漏出，側面透氣孔可以有效平衡飼養箱內外壓力，避免飼養箱因箱內壓力過高而爆裂，頂部接入的控氧儀探頭可以靈敏及時的感知飼養箱內氧分壓，并通過報警器上的顯示器顯示出來，同時控氧儀還可以通過電磁閥，及時調控氧氣管的開放和閉合，最終使飼養箱內氧濃度穩定在設定范圍。

KY－2F數字顯示控氧儀、電磁閥和有機玻璃的合理組合，得到氧氣濃度可以控制的小鼠飼養箱，通過與標準測氧儀的比較，發現飼養箱上的測氧儀可以準確測量飼養箱內氧分壓，并及時將電信號發送給報警裝置和電磁閥，始終維持飼養箱里氧分壓在需要范圍內，為順利進行試驗、消除誤差和結果穩定奠定了基礎，這也被以后的實驗結果所證實。

我們應用自己設計的氧濃度可控制小鼠飼養箱，按照文獻建議的方法［1，9］，6只在氧箱內飼養的 C57BL/6J新生小鼠，第17d視網膜全部誘導出了新生血管(3只新生小鼠視網膜做HE染色，3只新生小鼠視網膜做鋪片)，而在正常環境中飼養的新生小鼠第17d視網膜完全血管化，并且沒有新生血管生成，并已有相關論文發表［10－12］。

總之，該裝置設計合理，控制飼養箱內氧分壓快速準確，相關部件全部國產，價格不貴，維修方便，既解決了間斷測氧的繁瑣和不能維持飼養箱內氧分壓始終在75%左右的缺點，又避免了購買高壓氧艙和早產兒暖箱的高昂費用，既滿足了本研究需要，又可在其它相關研究使用，具有一定推廣價值。