高效液相色譜和超高效液相色譜法測(cè)定乳制品中三聚氰胺含量的對(duì)比

1 引言

三聚氰胺(英文名Melamine)，簡(jiǎn)稱三胺，又名蜜胺、氰尿酰胺。分子式C3N3H6,分子量126.12。白色結(jié)晶粉末，無(wú)味，相對(duì)密度1570kg/m3。微溶于水（3.1g/L常溫），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚類、對(duì)身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。[1,2]

但由于目前食品檢測(cè)中測(cè)定蛋白質(zhì)的凱氏定氮法是通過(guò)測(cè)定樣品中氮原子含量來(lái)間接推算出蛋白質(zhì)含量的，而此方法無(wú)法識(shí)別氮的來(lái)源，蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，而是三聚氰胺含氮量高達(dá)66.67%，少量添加即可大大提高產(chǎn)品的含氮量，不法商人借此提升食品檢測(cè)蛋白質(zhì)含量指標(biāo)，從而通過(guò)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)[3]。

而對(duì)于三聚氰胺的測(cè)定方法有很多，例如液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法、分光光度法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）等，其中毛細(xì)管電泳法和分光光度法靈敏度低，只可滿足一般檢測(cè)要求；氣相色譜-質(zhì)譜法需要衍生化步驟，操作繁瑣；ELISA則只適用于大批樣快速篩選檢測(cè)，若為陽(yáng)性需進(jìn)一步確證[4]。而液相色譜法為國(guó)標(biāo)中乳與乳制品檢測(cè)的推薦方法，可定性定量[5]，但普通液相色譜法仍有測(cè)定樣品周期長(zhǎng)，產(chǎn)生廢液量大的缺點(diǎn)，故本文對(duì)原有HPLC方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化并優(yōu)化，建立超高效液相色譜（UPLC）法，為乳制品中三聚氰胺含量的測(cè)定提供更快速、高效、靈敏和環(huán)保的方法。

2 材料

2.1 儀器

島津LC_20AB型高效液相色譜儀（日本 島津）；Waters Acquity UPLC 超高效液相色譜儀(美國(guó) 沃特世)；AG285 型天平(瑞士 梅特勒)；超純水儀(美國(guó) 密理博）。

2.2 試劑

三聚氰胺對(duì)照品（CAS 108-78-01,純度大于99.0%）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、辛烷磺酸鈉（色譜純）、超純水。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

3.1.1 HPLC色譜條件：色譜柱為 Agilent Zorbax SB_C18柱（250mm×4.6mm,5μm）;以離子對(duì)試劑緩沖溶液（2.10g檸檬酸+2.16g辛烷磺酸鈉定容1L,pH為3.0）與乙腈為流動(dòng)相，V:V=95:5；流速1.0mL/min；柱溫40℃；波長(zhǎng)240nm；進(jìn)樣量10μL

3.1.2 UPLC色譜條件：色譜柱為 Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm×100mm,1.7μm）;以離子對(duì)試劑緩沖溶液（2.10g檸檬酸+2.16g辛烷磺酸鈉定容1L,pH為3.0）與乙腈為流動(dòng)相，V:V=95:5；流速0.5mL/min；柱溫40℃；波長(zhǎng)240nm；進(jìn)樣量0.5μL。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取100mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶，用甲醇水溶液（1:1）溶解并定容至刻度，配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保存。用流動(dòng)相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到濃度為0.2、2.0、10.0、20.0、30.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，過(guò)微孔濾膜后備用。在HPLC條件下三聚氰胺的保留時(shí)間為15.12min,在UPLC條件下保留時(shí)間為1.12min，見(jiàn)下圖。

3.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取2g試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入15mL1%三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超聲并振蕩后，以4000r/min離心10min，上清液過(guò)濾后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL濾液，加入5mL水混勻后轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。依次以3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近干，用6mL氨化甲醇（5%）溶液洗脫。洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镉?mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1min，過(guò)微孔濾膜備用。

圖1 A HPLC三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品 B UPLC三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品）

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 線性關(guān)系考察

HPLC方法：按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件，濃度由低到高依次進(jìn)樣10.0μL，以峰面積（Y）-濃度（X）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=1.69×105+3.07×105 ,r2=0.9989,三聚氰胺在0.2～30μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

UPLC方法：按“3.1.2”項(xiàng)下色譜條件，濃度由低到高依次進(jìn)樣0.5μL，以峰面積（Y）-濃度（X）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=1.84×103+1.35×103,r2= 0.9999,三聚氰胺在0.2～30μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

3.4.2 精密度試驗(yàn)

HPLC方法：取“3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，以10.0μL進(jìn)樣量，連續(xù)進(jìn)樣6次，得三聚氰胺保留時(shí)間的RSD為15.21min，峰面積的RSD為0.20%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

UPLC方法：取“3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，以0.5μL進(jìn)樣量，連續(xù)進(jìn)樣6次，得三聚氰胺保留時(shí)間的RSD為1.12min，峰面積的RSD為0.16%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取濃度為20.0μg/mL的標(biāo)液，照“3.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶測(cè)定三聚氰胺的含量，HPLC和UPLC的RSD分別 0.58%、0.44%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

HPLC方法：取“3.3”項(xiàng)下供試品溶液，以10.0μL進(jìn)樣量，分別于0,2,4,8,10，12,24h注入HPLC，得三聚氰胺峰面積的RSD為0.66%，結(jié)果表明樣品中三聚氰胺在24h內(nèi)穩(wěn)定。

UPLC方法：取“3.3”項(xiàng)下供試品溶液，以0.5μL進(jìn)樣量，分別于0,2,4,8,10，12,24h注入U(xiǎn)PLC，得三聚氰胺峰面積的RSD為0.54%，結(jié)果表明樣品中三聚氰胺在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液做加標(biāo)回收試驗(yàn)，取六個(gè)平行樣，分別加入定量三聚氰胺對(duì)照品，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.4.6 樣品含量的測(cè)定

取不同品牌不同批次的乳制品20批，分別按“3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，并分別按照HPLC和UPLC色譜檢測(cè)條件，測(cè)定其中三聚氰胺的含量，用外標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果表明HPLC和UPLC均未檢出三聚氰胺，見(jiàn)圖2。

圖2 C HPLC三聚氰胺樣品 D UPLC三聚氰胺樣品

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比HPLC和UPLC法對(duì)乳制品中三聚氰胺含量的測(cè)定結(jié)果表明，兩種方法的精密度、準(zhǔn)確性等方面的差異不大，但在靈敏度方面UPLC明顯高于HPLC,并且UPLC還具有分析時(shí)間短，流動(dòng)相消耗量低的優(yōu)點(diǎn)，而在對(duì)乳制品的實(shí)際檢驗(yàn)中，UPLC更能顯現(xiàn)出環(huán)保、高效的優(yōu)點(diǎn)，可以在對(duì)市面流通乳制品質(zhì)量的控制中得到廣泛應(yīng)用。

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