修復劑調控鉛鎘污染棉田對土壤微生物多樣性的影響①

安夢潔，王開勇，王海江，鄂玉聯，孟春梅

修復劑調控鉛鎘污染棉田對土壤微生物多樣性的影響①

安夢潔，王開勇*，王海江，鄂玉聯，孟春梅

(石河子大學農學院，新疆石河子 832000)

為探討重金屬鉛(Pb)、鎘(Cd)污染下棉粕腐植酸和聚丙烯酸鉀修復劑對土壤微生物多樣性的影響，采用田間桶栽試驗，進行了棉粕腐植酸、聚丙烯酸鉀以及兩者復合施用修復污染棉田土壤的研究，通過高通量測序分析了土壤微生物多樣性的變化，并利用傅里葉紅外光譜進行了土壤化學結構的修復響應分析。結果表明：與未施用修復劑處理相比，施用棉粕腐植酸和聚丙烯酸鉀減少了表層土壤Pb、Cd含量，其中兩者復合處理可分別減少62.6% 和52.3%；改變了土壤微環境進而影響了土壤微生物多樣性，不同處理共發現土壤細菌25 個門，69個綱，149個目，273個科，442個屬，其中優勢菌門主要為變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門。聚丙烯酸鉀處理增加了土壤中變形菌門的相對豐度，棉粕腐植酸和復合修復處理增加了酸桿菌門和芽單胞菌門的相對豐度。由此可見，鉛鎘復合污染土壤中微生物多樣性豐富，優勢菌群相對穩定，聚丙烯酸鉀和棉粕腐植酸通過改變土壤微環境進而影響菌群豐度。

鉛鎘污染；腐植酸；聚丙烯酸鉀；高通量測序；傅里葉紅外光譜

鉛(Pb)、鎘(Cd)在土壤中具有不可降解性、積累性和不可逆性，對人類健康和土壤生態環境安全存在著巨大風險[1-2]。新疆是全國最大的棉花生產基地，化肥施用量年增長率為11%，居全國首位，化肥用量在750 ~ 900 kg/hm2，由化肥帶入的重金屬含量雖然不高，但長期的累積和施肥的單一性，均會導致重金屬含量超過新疆土壤表面背景值(Pb 19.4 mg/kg，Cd 0.12 mg/kg)[3]，造成退化棉田土壤修復緩慢。

土壤微生物的數量和活性與土壤功能密切相關，因此常常被用作土壤修復和退化的評價指標[4-5]。同時，土壤微生物的存在還會對土壤物理化學結構產生重要的影響。有研究表明，重金屬污染土壤中細菌數量發生明顯改變[6]，主要是因為微生物重要的代謝過程受到重金屬的影響[7]。

眾多環境修復劑都可以降低土壤重金屬復合污染帶來的影響。以往的研究主要圍繞著修復劑調控下重金屬復合污染土壤中重金屬含量、團粒結構和養分含量[8-9]等方面開展。其中，對土壤微生物菌落特征的影響，主要研究了微生物數量。不同類群微生物對重金屬敏感性不同[10-12]，敏感性大小通常是放線菌>細菌>真菌[13]。

腐植酸是結構復雜的多元有機復合體，能和金屬離子通過吸附、交換和絡合等作用合成有機-金屬絡合物，吸附穩定性強，對土壤中金屬離子的遷移、轉化、生物活性起著重要作用[14]。聚丙烯酸鹽對多種重金屬具有較強和穩定的吸附能力，在外加重金屬污染土壤上，可以顯著降低土壤中重金屬的有效性[9]。但目前環境修復劑對微生物菌落特征的影響和土壤化學響應尚不清楚。為更全面地闡述聚丙烯酸鉀和棉粕腐植酸在重金屬污染土壤上的修復作用，本研究進一步探討了聚丙烯酸鉀和棉粕腐植酸對重金屬污染土壤微生物多樣性的影響。本研究分析了鉛鎘污染棉田中施用聚丙烯酸鉀和棉粕腐植酸修復劑后土壤Pb、Cd的含量及其分布特征，利用Illumina平臺高通量測序技術分析了土壤中微生物的群落結構變化，及通過傅里葉紅外光譜分析了土壤中化學結構的變化，進而探究了聚丙烯酸鉀和棉粕腐植酸修復土壤重金屬污染過程中微生物種群的變化特征，并結合土壤化學結構特征變化分析其修復響應，為更好地做好土壤重金屬污染調控工作提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗在新疆石河子大學農學院實驗站 ( 45°19′ N，86°3′E)進行。實驗站海拔 450.8 m，年平均氣溫 7.5 ~ 8.2℃，日照時數 2 318 ~ 2 732 h，無霜期147 ~ 191 d，年降雨量 180 ~ 270 mm，年蒸發量 1 000 ~ 1 500 mm，屬典型的溫帶大陸性氣候。試驗區土壤為灌溉灰漠土，質地為重壤，耕層土壤全氮 0.89 g/kg，有效磷20 mg/kg，速效鉀250 mg/kg，堿解氮60 mg/kg，pH 8.2，有機質13.25 g/kg，Cd 0.06 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗為桶栽試驗，供試作物為棉花“新陸早60”。通過室內試驗篩選Cd、Pb污染濃度，桶栽試驗設置人為添加超過國家《農用地土壤環境質量標準GB 15618—2016》中耕地pH>7.5含量限值(Cd 0.6 mg/kg，Pb 200 mg/kg)3倍量的重金屬Cd、Pb(試驗后的污染土壤進行長期監測)。修復材料為棉粕腐植酸(自主研發：總腐植酸35 g/L)和聚丙烯酸鉀。采用完全隨機區組試驗設計，設置4個處理(表1)，每處理重復3次。

試驗過程中，原狀土按土層裝于塑料桶(長× 寬×高= 2 m × 2 m × 80 cm)中，并埋回實驗站大田，保持大田群體效應。選用氯化鎘和乙酸鉛，按照0 ~ 30 cm土層計算，以溶液的形式加入供試土壤中，充分混勻后一次性澆灌農田灌溉水保持土壤濕潤。于2016年5月初播種，出苗后定苗；6月14日第一次灌水，灌水周期為10 d。全生育期共灌水9次，修復材料(棉粕腐植酸和聚丙烯酸鉀)每次隨水施入，2016年9月底收獲。全生育期施尿素345 kg/hm2、復合肥(17-17- 17)555 kg/hm2、聚丙烯酸鉀4.8 kg/hm2、棉粕腐植酸150 kg/hm2。

表1 試驗設置

1.3 取樣與測定

1.3.1 取樣 在棉花各生育時期(苗期、蕾期、花期、鈴期、吐絮期)采集0 ~ 20、20 ~ 40 cm土樣，每個小區采3點混合并用“四分法”縮分獲得1個土樣。土樣自然風干后過 2 mm 篩，放入塑料袋中保存備用測定Pb、Cd含量。吐絮期的一部分土樣在4℃下運輸1 h，過2 mm篩進行徹底均勻化并從樣品中除去根和植物碎屑，儲存在–80℃以備DNA提取，一部分土樣常溫儲存用于傅里葉紅外光譜(FTIR)分析。

1.3.2 土壤微生物總DNA提取 土壤總DNA基因組采用DNA提取試劑盒進行提取，使用瓊脂糖凝膠電泳對 DNA 的濃度和質量進行檢驗。所有樣品基因組 DNA 提取和 16S rDNA 擴增與測序工作委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.3.3 高通量測序 高通量測序采用通用引物 (338F/806R) 對土壤細菌 16S rRNA 基因的 V3 ~ V4 區擴增，修飾后的通用引物含有不同的 Tag 標簽用以區分不同樣品[15]。根據PE reads之間的重疊關系，將Hiseq測序得到的雙端序列數據拼接成一條序列Tags，同時對Reads的質量和拼接的效果進行質控過濾。

1.3.4 微生物多樣性指數計算

Shannon-Wiener指數計算公式為：

'=-∑P(lnP) (1)

Simpson指數計算公式為：

= 1-ΣP2(2)

式中：P指種的個體數占群落中總個體數的比例。

ACE 指數計算公式為：

式中：n表示含有條序列的 OTU 數目；rare表示含有“abund”條序列或者少于“abund”的 OTU 數目；abund表示多于“abund”條序列的 OTU 數目；“abund”為“優勢”OTU 的閾值，本研究取值 10。

Chao1 指數計算公式為：

式中：chao1表示估計的 OTU 數；obs表示實際 OTU 數；1表示只有 1 條序列的 OTU 數目；2表示只有 2 條序列的 OTU 數目。

1.3.5 土壤重金屬含量的測定 土壤通過微波消解后采用石墨爐原子吸收分光光度法進行總Cd和總Pb測定(GB/T 17141—1997)。實驗儀器為PinAAcle 900H 原子吸收光譜儀 (PHDS15010901)。

1.3.6 FTIR測試 紅外光譜分析采用BRUKER EQUINOX55型紅外光譜儀，分束片KBr，分辨率4 cm–1。

1.4 數據處理

數據處理和繪圖用 Microsoft Excel 2016軟件進行。方差分析和主成分分析采用SPSS 16.0 統計分析軟件進行。比較不同處理間差異采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 修復劑對土壤重金屬含量的影響

圖1為棉花各生育時期不同土層土壤中Cd的含量。從圖1中可以看出，各處理在20 ~ 40 cm土層中的Cd含量普遍低于0 ~ 20 cm土層，且在吐絮期修復效果最好。在0 ~ 20 cm土層，與T2處理相比，棉花苗期T6和T8處理Cd含量減少了41.2% 和39.2%，蕾期減少了37.5% 和45.0%，花鈴期減少了58.2% 和62.6%，吐絮期減少了56.8% 和61.6%；在20 ~ 40 cm土層，T4、T6和T8處理土壤Cd含量部分高于T2處理，說明修復材料的施入增加了重金屬Cd向土壤下層遷移的能力。

圖2為各生育時期不同土層土壤中Pb的含量。各處理在0 ~ 20 cm土層和20 ~ 40 cm土層中的Pb含量變化趨勢與Cd含量大體一致。在0 ~ 20 cm土層，T4、T6、T8處理各生育時期中Pb含量均低于T2處理，其中T8處理降低幅度最大，較T2處理在各生育期分別降低了54.0%、52.3%、19.2% 和45.3%；在20 ~ 40 cm土層，T4、T6、T8處理中土壤Pb含量大部分高于T2處理，且增加幅度大于Cd含量，說明修復材料促進重金屬Pb遷移的能力大于Cd。

(圖中小寫字母表示同一土層同一時期不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同)

圖2 棉花各生育時期不同土層土壤中Pb的含量

2.2 修復劑與重金屬污染土壤混合物的紅外光譜

利用紅外光譜可以推斷和半定量測定分子的官能團特征，進一步驗證有機化合物的結構組成。圖 3顯示，各處理下土壤的混合物紅外光譜曲線具有大致相似的特征，只在某些特征峰的吸收強度上有一定的差異(表2)。從圖3可以看出，各處理在3 000 cm–1以上有吸收峰，說明表面有不飽和基團的存在。與T2處理相比，T4、T6、T8處理在2 920 cm–1和2 850 cm–1附近的波谷消失，2 920 cm–1附近的波谷為亞甲基(CH2)的碳氫(C-H)反對稱伸縮振動谷，2 850 cm–1附近吸收峰為CH2的C-H對稱伸縮振動[16]。1 620 ~ 1 650 cm–1處是締合態伯酰胺面內彎曲振動(δN-H)的吸收帶，其中1 634 cm–1左右的峰值為酰胺化合物的吸收Ⅰ帶(包括-CONH-中的C-O伸縮振動)[17]。1 402 ~ 1 440cm–1處是羧酸根離子(COO-)的特征吸收峰，是由于羧酸中C-O伸縮振動引起的；在1 032 cm–1附近為酯類-C-O-C-、CH、C-C、C-O多糖鍵的伸縮振動吸收帶[18]。693 cm–1附近的吸收峰與羥基的彎曲變形振動有關；521 cm–1附近的吸收峰表現為Si-O-Mg、Si-O-Al鍵的彎曲振動[19]；467 cm–1附近的吸峰表現為Si-O-Si的彎曲振動[20]。

由表2可見，在2 920、2 850、1634、1433、1 032 cm–1處，土壤混合物吸收峰的吸光度在施用修復材料處理下較高，重金屬處理下降低，其中T4處理的吸光度最高，因此這些峰也可作為鑒定重金屬污染土壤的標志之一。

圖3 修復材料與重金屬污染土壤的混合物FTIR測試結果

2.3 修復劑對重金屬污染土壤微生物多樣性的影響

2.3.1 土壤微生物復雜度 Alpha 多樣性表示的是對單個處理土壤微生物多樣性進行分析。表 3顯示，各處理土壤微生物群落多樣性變化規律不明顯，各處理間群落豐富度無明顯差異，無法結合多樣性指數對群落多樣性進行準確分析。

表2 不同處理修復材料與重金屬污染土壤混合物紅外光譜主要吸收峰的相對強度(半定量)

表 3 不同處理土壤微生物多樣性指數統計表

注：表中同列小寫字母不同表示不同處理間差異顯著 (<0.05)，下表同。

2.3.2 土壤細菌群落組成 土壤細菌種類繁多, 數量最多，多樣性特征較為明顯。圖4分別為本研究4個處理在門、綱、目、科、屬水平上的相對豐度直觀展示圖。在門和綱水平上的優勢種是變形菌門(綱)(Proteobacteria)、酸桿菌門(綱)(Acidobacteria)和芽單胞菌門(綱)(Gemmatimonadetes)，目和科水平上優勢種是芽單胞菌目(科)(Gemmatimonadales)和鞘氨醇單胞菌目(科)(Sphingomonadaceae)，其中鞘氨醇單胞菌目(科)屬于變形菌門(Proteobacteria)[21]。

在門水平上，T2、T4、T6、T8處理中物種相對豐度不同，T2處理中擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門、變形菌門相對豐度較T4、T6、T8處理低，綠彎菌門(Chloroflexi)和放線菌門(Actinobacteria)相對豐度較T4、T6、T8處理高。在綱水平上，與T4、T6、T8處理相比，T2處理α-變形菌綱(Alphapro-teobacteria)和β-變形菌綱(Betaproteobacteria)相對豐度較低，δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)相對豐度較高。在目水平上，與T4、T6、T8處理相比，T2處理鞘脂單胞菌目相對豐度較低。在科水平上，與T4、T6、T8處理相比，T2處理芽單胞菌科和鞘脂單胞菌科相對豐度比例較低。在屬水平上，T2、T4、T6、T8處理鞘氨醇單胞菌屬()相對豐度分別為4.30%、5.29%、6.34%、5.60%，菌屬相對豐度分別為1.56%、1.59%、1.45%、1.59%。

Fig. 4 Changes in relative abundance of bacterial under different treatments

2.3.3 土壤微生物物種豐度聚類熱圖 如圖5所示，基于OTU 結果用不同顏色變化來表示分類信息和處理間差異。圖左側的聚類樹為物種聚類樹；上方的聚類樹為處理聚類樹；中間熱圖對應的值為每一行物種相對豐度經過標準化處理后得到的值(值越高顏色越接近紅色，值低則接近藍色)。由圖5可以看出，不同處理間差異較大，T2處理中含量較高的門包括放線菌門(Actinobacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和硬壁菌門(Firmicutes)，T4處理中含量較高的門包括BRC1、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和廣古菌門(Euryarchaeota)，T6處理中含量較高的門包括綠細菌門(Chlorobi)、TM7和WCHB1-60，T8處理中含量較高的門包括硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、WS6、浮霉菌門(Planctomycetes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)和TM6。從圖5中還可以看出，T4和T8處理的相似性較近，聚為一類；T2處理位于較遠的聚類分支上，且T2處理與其他組在顏色分布上相差較大。

圖5 各處理門水平豐度聚類熱圖

3 討論

Pb、Cd的遷移能力較弱，試驗表明修復劑的施用降低Cd含量的效果優于Pb含量，即Pb的遷移能力強于Cd，并且土壤0 ~ 20 cm土層的修復效果明顯優于20 ~ 40 cm土層。在堿性土壤環境下，聚丙烯酸鹽帶有陰性電荷，有很好的保水性、吸水性，還有很強的吸附能力，自身所帶羧基等強親水基團，對水分子和重金屬離子同時具有很強的吸附、絡合能力[9]。腐植酸中的羥基、羧基功能團能與土壤中的金屬陽離子發生結合反應，提高土壤保水能力，具有改良土壤效果[22]。在本研究中自主研發的棉粕腐植酸使鉛鎘復合污染土壤中羧酸、酯類多糖、酰胺化合物等增加，降低了土壤Pb、Cd含量，減輕了其環境的毒害作用。

本研究在鉛鎘復合污染土壤中施加聚丙烯酸鉀和棉粕腐植酸，能改變土壤微生物種群結構和土壤Pb、Cd含量，這與前人的研究相同[23-24]。為探討棉粕腐植酸和聚丙烯酸鉀對土壤微生物多樣性的影響，本研究利用高通量測序，對4個處理細菌群落在門、綱、目、科、屬分類層次上的分布特征分析顯示，4個處理擁有共同的常見絕對優勢菌群，而相對比例較低的細菌群落多樣性各不相同，有顯著的差別。本研究中細菌菌群的這種多樣性分布特點，論證了一種經典物種多度分布模式，即物種在地球上的分布并非是均勻的，幾乎所有的群落都呈現出大量的稀有種和少數常見種[25-26]。不同處理共發現25 個門，69個綱，149個目，273個科，442個屬，其中優勢菌門主要為變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門。聚丙烯酸鉀和棉粕腐植酸能影響這些細菌的相對豐度。在25個門的細菌中，與不加修復材料的鉛鎘復合土壤相比，棉粕腐植酸提高了16個門細菌豐度，聚丙烯酸鉀提高了11個門細菌豐度，修復材料復合施用提高了14個門細菌豐度。在優勢菌門中，聚丙烯酸鉀提高了變形菌門相對豐度，棉粕腐植酸的酸桿菌門和芽單胞菌門相對豐度較高。

FTIR測試分析和高通量測序表明環境修復劑的施用改變了土壤微環境，土壤微環境和土壤微生物之間互相影響互相制約。其中2 850 cm–1和2 920 cm–1處吸收峰的光譜值和Simpson指數呈極顯著正相關(<0.01)，說明修復劑增加了細菌群落均勻度。有研究表明，在水稻田中變形菌門(Proteobacteria)中的微生物耐重金屬[6]，而在本研究中發現棉田綠彎菌門(Chloroflexi)和放線菌門(Actinobacteria)中的微生物對Cd較不敏感。放線菌門是一種沒有細胞核的原核生物，能促使土壤中的動物和植物遺骸腐爛，綠彎菌門是兼性厭氧生物，在光合作用中不產生氧氣，不能固氮。FTIR分析和高通量測序表明，碳氫鍵的形成為綠彎菌門(Chloroflexi)和放線菌門(Actinobacteria)提供了良好的環境，有利于提高其豐度。而修復材料的施用降低了土壤Pb、Cd的有效性，破壞了碳氫鍵，進而減少了綠彎菌門和放線菌門的豐度。與此同時，T4和T8處理使土壤中羧酸、酯類多糖、酰胺化合物等增加，增加了酸桿菌門(Acidobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的豐度，它們在生態系統中具有重要作用。T6處理增加了變形菌門(Proteobacteria)豐度，變形菌門可以利用光合作用儲存能量，具有固氮功能。總之，棉粕腐植酸和聚丙烯酸鉀的添加改善了土壤重金屬含量及土壤化學結構，提供了微生物生命活動和繁殖所需的環境條件。

4 結論

1)在Pb、Cd復合污染的土壤中，2 920 cm–1和2 850 cm–1處波谷表明土壤表面與金屬離子相互作用形成碳氫鍵，聚丙烯酸鉀和棉粕腐植酸能有效降低土壤表層Pb、Cd含量，其中對Cd的最大減少量有62.6%，Pb、Cd向下的遷移能力提高。

2)在堿性Pb、Cd污染土壤條件下，細菌的豐度總體較高，施用修復劑使微生物多樣性存在一定差異，即少數的常見菌群相對比例較高。不施用修復劑時放線菌門豐度較高，平均含量達到19.10%；聚丙烯酸鉀修復劑增加了變形菌門豐度，平均比例高達 39.89%；棉粕腐植酸增加了酸桿菌門和芽單胞菌門豐度，平均比例分別高達19.76% 和15.30%。修復劑通過碳氫鍵機理影響土壤微環境進而改變了土壤微生物均勻度。

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Effects of Remediation on Microbial Diversity of Soil Polluted by Pb and Cd

AN Mengjie, WANG Kaiyong*, WANG Haijiang, E Yulian, MENG Chunmei

(Agricultural College of Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 823000, China)

A tub experiment was conductedto investigate the effects of humic acid and potassium polyacrylate on soil biological diversity under heavy metal lead (Pb) and cadmium (Cd) pollution, in which 600 mg/kg of Pb and 1.8 mg/kg of Cd were added into all tubs (T2), then 10 g/kg of cottonseed meal humic acid (T4), 2 g/kg of polyacrylic acid potassium (T6), the combination of T4 and T6 (T8) were added into the tubs, respectively. Soil microbial biodiversity was analyzed by high-throughput sequencing and the remediation response was studied by Fourier transform infrared spectrum. The results showed that the contents of Cd and Pb in the topsoil were reduced in the treatments of T4, T6 and T8, the maximum reduction occurred in T8, which were 62.6 % for Cd and 52.3% for Pb, respectively, thus, it changed soil micro-environment and thus affected soil microorganisms. The bacteria in the four treatments covered 25 phyla, 69 classes, 149 orders, 273 families and 442 genera, and Proteobacteria, Acidobacteria, Gemmatimonadetes and Actinobacteria were the dominant bacteria. T6 increased the total number of Proteobacteria, while T4 and T8 increased Acidobacteria and Gemmatimonadetes. It can be concluded that the microbial diversity was very rich and the dominant bacterial community was relatively stable in Cd and Pb polluted soil. Potassium polyacrylate and cottonseed meal humic acid affected composition abundance of bacterial flora by changing soil microenvironment.

Lead and cadmium pollution; Humic acid; Potassium polyacrylate; High-throughput sequencing; Fourier transform infrared spectrum

國家國際科技合作專項(2015DFA11660)、國家科技支撐計劃項目(2014BAC14B030-2)、國家重點研發計劃項目(2016YFC 0501406)、國家自然科學基金項目(31560169)和石河子大學國際科技合作項目(GJHZ201802)資助。

(wky20@163.com)

安夢潔(1993—)，女，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，主要從事土壤環境與生態研究。E-mail: 1505744711@qq.com

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10.13758/j.cnki.tr.2019.03.018