添加順序對β-乳球蛋白與EGCG及葡萄糖三元復合物結構和功能的影響

姚文俊，周 磊，付珊琳，鐘俊楨*，劉成梅

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是牛奶中乳清蛋白的主要成分，約占50%[1]。β-LG在中性pH值下為單體和二聚體共存狀態。每個單體由162 個氨基酸殘基組成，分子質量約為18.4 kDa[2]。它含有8 個反平行β-折疊和α-螺旋[3]。β-LG是一種優良的天然活性載體[4]，它可以結合多種活性物質，包括親水性、疏水性和兩親性物質。

食物體系是一個多重復雜的系統。目前，大量研究報道了β-LG和其他活性物質的組合對其結構和功能的影響。最常見的方法有2 種，一種是直接混合以氫鍵、疏水鍵為主要作用力形成非共價復合物[5]。Li Min等[6]通過熒光等光學手段研究了牛血清白蛋白與表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）間的非共價結合。姜黃素與β-LG通過疏水相互作用結合后，蛋白質結構發生變化，姜黃素的抗氧化活性得到改善[7]。然而，由疏水鍵、氫鍵等形成的非共價復合物易受溶液和環境的影響而發生可逆現象[8-9]。一種是以堿處理、酶催化、自由接枝聚合、美拉德反應等方法共價結合形成共價復合物，例如Wu Xuli等[10]通過自由基法得到β-LG與EGCG和綠原酸（chlorogenic acid，CA）共價復合物，發現β-LGEGCG和β-LG-CA可以降低β-LG的致敏性。蛋白質與其他物質形成共價復合物是當前的研究熱點。通過共價處理形成的共價鍵是不可逆的，且其復合物更穩定[11-12]。特別地，共價形成的復合物較非共價復合物具有更好的結構和功能特性。β-LG與兒茶素通過自由基接枝法得到的共價復合物與非共價復合物對比發現，共價復合物的抗氧化性和對β-胡蘿卜素的保留率有所提高[13]。乳清分離蛋白與EGCG通過堿法得到共價復合物后，起泡性和乳化性都得到改善[14]。牛血清白蛋白和葡聚糖的共價復合物可以抑制牛血清白蛋白的聚集，而二級結構不受美拉德反應時間的影響[15]。但是，大量的研究都集中在2 種物質的結合上，例如蛋白質和多酚，蛋白質和多糖以及其他二元復合物，目前關于β-LG與多酚和多糖的三元共價復合物的影響研究較少。

近年來，三元復合物成為研究的熱點，三元復合物較二元復合物會展現更多不同的結構功能性質。如Harbertson等[16]發現單糖和雙糖可以形成氫鍵增加單寧與蛋白質之間的作用力，并提高蛋白質單寧復合物的溶解度。多糖還可以競爭抑制蛋白質多酚復合物的聚集[17]。此外，多酚也會對蛋白質和多糖的復合物產生影響。槲皮素可通過靜電和疏水相互作用增加阿拉伯膠與β-LG的相互作用[18]。因此，多糖對蛋白質-多酚復合物和多酚對蛋白質-多糖復合物有不同的影響。對于特定的蛋白質多酚多糖，不同的添加順序將影響復合物之間的結構和功能性質。Yang Wei等[19]以不同的添加順序獲得乳鐵蛋白，果膠和EGCG三元非共價復合物。發現EGCG和果膠的添加順序在最終形成的復合物的結構和功能方面差異很大。然而，目前大多數研究都集中在非共價復合物上。對于不同添加順序對三元共價結合復合物結構的影響以及與非共價復合物的區別尚不清晰。

因此，本研究采用2 種方法形成不同添加順序的β-LG、EGCG和葡萄糖（glucose，Glc）共價復合物和非共價復合物。通過熒光光譜和圓二色（circular dichroism，CD）光譜表征其結構變化，并比較它們的起泡性和乳化性質。探討不同添加順序對復合物的影響以及共價復合物與非共價復合物的區別，為食品加工順序對食品體系的影響研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳β-LG、EGCG 美國Sigma公司；8-苯胺基-1-萘磺酸鈉（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、過硫酸氨（ammonium persulphate，AP）、Glc 北京索萊寶生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FreeZone 12-Plus真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；Ultra-TurraxT25高速分散機 德國IKA公司；UV-1600PC紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；F-7000熒光分光光度計 日本Hitachi公司；Mini-Protean Tetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；MOS-450 CD光譜儀 法國Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 共價復合物及非共價復合物的制備

參考Rawel等[20]的方法，采用堿法合成β-LG-EGCG共價復合物。0.25 g β-LG溶解在25 mL去離子水中攪拌過夜，然后用0.1 mol/L NaOH溶液將蛋白質溶液的pH值調節至9.0。稱取4 mg EGCG溶解在25 mL去離子水中，使其濃度為0.35 mmol/L，并將pH值調至9.0。蛋白質溶液與EGCG溶液按體積比1∶1混合并連續攪拌24 h（加入質量分數0.02%的疊碳化鈉）。然后透析48 h除去多余的多酚。最后，冷凍干燥得到樣品。

參考Liu Fuguo等[21]的方法，采用美拉德反應制備β-LG-EGCG-Glc共價復合物，稱取β-LG-EGCG共價復合物凍干樣品與Glc分別溶解在去離子水中，質量濃度為20 mg/mL，等比例混合后用0.1 mol/L的HCl溶液調節pH值至7.0，冷凍干燥得到凍干樣品后放入裝有飽和溴化鉀溶液的干燥器中（60 ℃，相對濕度79%）反應24 h得到β-LG-EGCG-Glc共價復合物。

按照上述方法，按不同的順序制備β-LG-Glc-EGCG 共價復合物。非共價復合物的制備除去共價復合物制備過程中的堿法和美拉德反應外，其余步驟與上述方法相同。將β-LG-EGCG-Glc共價復合物命名為β-LGEGCG-Glc con，β-LG-Glc-EGCG共價復合物命名為β-LGGlc-EGCG con；β-LG-EGCG-Glc非共價復合物命名為β-LG-EGCG-Glc mix，β-LG-Glc-EGCG非共價復合物命名為β-LG-Glc-EGCG mix。

1.3.2 SDS-PAGE分析

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）根據Laemmli等[22]的方法并略作改動。使用濃縮膠5%、分離膠12%。首先恒定電壓80 V維持15 min后換成恒定電壓200 V維持45 min。每個孔的上樣量為10 μL。電泳之后，通過考馬斯亮藍R-250對凝膠條帶進行染色后再用脫色液脫色。采用低分子質量的蛋白質標準物（10～180 kDa）評估樣品的分子質量。

1.3.3 紫外-可見吸收光譜分析

參照文獻[23]方法，略作修改。將制備的凍干樣品用蒸餾水（pH 7.0）配制成0.25 mg/mL的溶液。測定波長294 nm和420 nm處的吸光度，A294nm和A420nm分別表示美拉德反應中級階段產物和高級階段產物顏色深淺度的變化。采用蒸餾水作為空白參照。

1.3.4 內源熒光光譜測定

采用F-7000熒光分光光度計測定樣品的熒光變化。用pH 7.0的10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液將樣品配制成質量濃度為1 mg/mL。其中激發波長為295 nm，發射波長為300～400 nm，激發和發射狹縫均為2.5 nm，以未加樣品的緩沖液作為空白。

1.3.5 表面疏水性測定

參考文獻[24]的方法，采用ANS作熒光探針測定表面疏水性。稱取樣品溶于pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液中，質量濃度為1 mg/mL。取4 mL樣品溶液，加入20 μL ANS溶液，旋渦振蕩30 s后避光靜置10 min，使用F-7000熒光分光光度計測定，激發波長為390 nm，發射波長為400～600 nm，以熒光強度表示表面疏水性。

1.3.6 遠紫外CD光譜分析

用磷酸鹽緩沖溶液配制成0.1 mg/mL蛋白樣品。采用光路長為0.1 cm的圓形石英比色皿進行遠紫外CD光譜分析，掃描范圍為185～250 nm。掃描9 次取平均值。

1.3.7 乳化性及乳化穩定性測定

根據文獻[25]的方法，取6 mL樣品溶液，加入3 mL一級大豆油，使用ULTRA-TURRAX分散機以13 000 r/min均質1 min，從底部吸取50 μL，立刻與5 mL 0.1% SDS混合搖勻。然后于500 nm波長處測吸光度A0。10 min后再次吸取50 μL乳狀液與5 mL 0.1% SDS溶液混合均勻，在500 nm波長處測吸光度A10，實驗重復3 次取平均值。乳化性及乳化穩定性按公式（1）、（2）計算：

式中：ρ為稀釋前的蛋白質質量濃度/（mg/mL）；L為光程（1 cm）；φ為形成乳液的油體積分數（0.25%）；DF為稀釋倍數（100）。

1.3.8 起泡性及泡沫穩定性測定

參考文獻[26]的方法，取10 mL樣品于精密刻度管中，記錄最初體積V0，然后使用ULTRA-TURRAX分散機以13 000 r/min均質1 min，記錄體積V1，靜置30 min后記錄體積V2。實驗重復3 次取平均值。起泡性及泡沫穩定性按公式（3）、（4）計算：

1.4 數據統計分析

實驗結果重復3 次，采用Origin 8.0軟件繪圖，數據采用IBM SPSS Statistics 24軟件進行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

圖1 不同添加順序形成的共價復合物和非共價復合物SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE profiles of covalent and non-covalent complexes formed by different addition sequences

SDS-PAGE主要用于表征β-LG與EGCG和Glc的共價結合過程。如圖1所示，天然β-LG分子質量在18 kDa和36 kDa左右，這是因為在中性pH值條件下β-LG的單體與二聚體共同存在。2 種不同添加順序的共價復合物的條帶都遷移較慢，復合物的分子質量變大，表明EGCG、Glc與蛋白共價結合。此外，2 種共價復合物還出現了不同分子質量的條帶，表明β-LG與EGCG、Glc之間還發生了蛋白質交聯。Kroll等[27]研究發現，EGCG在堿性條件下氧化成醌后，會更容易與蛋白質側鏈的賴氨酸、色氨酸等親核基團發生結合，同時作為一個親電子中間體更容易與蛋白質形成交聯聚合物。而非共價結合β-LG-Glc-EGCG mix、β-LG-EGCG-Glc mix的2 種復合物與天然β-LG的條帶相似，沒有發生明顯的條帶遷移。主要是由于SDS-PAGE中，SDS和β-巰基乙醇容易破壞蛋白質與多酚及糖之間的非共價作用健，而破壞不了共價作用鍵。

2.2 紫外-可見吸收光譜分析結果

美拉德反應的程度可以通過反應產物的顏色深淺反映，在波長294 nm和420 nm處的紫外-可見吸光度可以表示美拉德反應產物的進程。A294nm表示無色中間產物，A420nm表示末期褐變化合物[23]。由圖2可知，形成共價復合物后，A294nm和A420nm都明顯上升，這表明共價復合物產生了美拉德中間化合物，其中β-LG-Glc-EGCG con復合物在波長294 nm和波長420 nm處的吸光度都較β-LG-EGCG-Glc con復合物高。蛋白質與多糖發生美拉德反應時，蛋白質的氨基與Glc的羰基結合[28]。而多酚也會與蛋白質中的氨基酸殘基結合[29]。蛋白質與Glc先反應可以使更多的氨基與Glc的羰基結合，美拉德反應產物也更高。這也表明不同的添加順序形成的共價復合物產生的美拉德反應進程不同。對于不同添加順序形成的非共價復合物的吸光度與對照組間并沒有明顯的差異（P＞0.05），表明不同添加順序形成的2 種非共價復合物未發生美拉德反應，與SDS-PAGE結果一致。

圖2 294 nm和420 nm波長處β-LG及其共價復合物和非共價復合物紫外-可見吸收光譜圖Fig. 2 UV-Vis absorption spectra at 294 nm and 420 nm

2.3 內源熒光析

圖3 β-LG及其共價復合物和非共價復合物內源熒光光譜圖Fig. 3 Intrinsic fluorescence spectra

β-LG中含有色氨酸和酪氨酸殘基，屬于內源性熒光物質。通過內源熒光光譜可以分析β-LG的構象變化。本實驗采用激發波長295 nm，酪氨酸及苯丙氨酸不被激發，可以認為內源熒光來自色氨酸殘基[30]。由圖3可知，2 種不同添加順序的非共價三元復合物的熒光強度降低，但β-LG-EGCG-Glc mix（1 538 nm）和β-LG-Glc-EGCG mix（1 481 nm）兩者相差不大，且沒有出現明顯的紅移現象。而共價三元復合物較非共價復合物有更顯著的熒光猝滅，熒光強度降低顯著。β-LG-EGCG-Glc con和β-LG-Glc-EGCG con的熒光強度分別為545.9 nm和271.3 nm。這可能是共價復合物一方面形成了緊密的結構掩蓋了色氨酸殘基[31-32]，另一方面可能色氨酸參與了共價反應。劉夫國[33]在研究乳鐵蛋白與3 種多酚共價結合發現乳鐵蛋白的游離色氨酸含量減少，參與了共價反應。此外，β-LG-Glc-EGCG con有明顯的紅移現象（8 nm），而β-LG-EGCG -Glc con沒有明顯的紅移，說明不同添加順序形成的共價復合物會使蛋白產生不同的構象變化。Liu Fuguo等[21]研究綠原酸與乳鐵蛋白和Glc共價復合物發現，共價復合物比非共價復合物具有更低的熒光強度。本實驗結果與Liu Fuguo等[21]的研究結果一致。

2.4 表面疏水性結果

圖4 β-LG及其共價復合物和非共價復合物表面疏水性圖Fig. 4 Surface hydrophobicity spectra

蛋白質表面疏水性的變化可以通過ANS法檢測[34]。有研究報道，ANS與β-LG有2 個結合位點，一個作用在外部β-桶與α-螺旋間的疏水表面，一個作用在β-桶的內部疏水區域[35-36]。由圖4可知，非共價復合物和共價復合物的熒光強度都增加，但不同添加順序的非共價復合物熒光強度沒有差異（561.3、577.5 nm）。而共價復合物相差顯著（1 024、4 616 nm），表明不同的添加順序形成的共價復合物在表面疏水性上有很大差異。共價復合物均出現明顯藍移（49、51 nm），表明蛋白質的疏水基團結構暴露。可能的原因是EGCG和Glc與蛋白質的親水基團共價結合導致蛋白質內部結構改變，疏水基團被暴露。

2.5 CD光譜分析結果

遠紫外CD光譜范圍為178～250 nm，可以反映蛋白質等生物大分子主鏈的構象信息。包括α-螺旋、β-折疊以及無規卷曲等信息[30]。β-乳球蛋白包含3 個轉角的α-螺旋、9 個β-折疊股[37]，210～220 nm之間有負峰為β-折疊。從圖5可以看出，不同添加順序形成的共價復合物的二級結構發生不同程度的改變。β-LG-EGCG-Glc con與β-LGGlc-EGCG con的β-折疊峰都發生了藍移，表明β-LG的β-折疊含量發生了改變。通過DichroWeb程序計算得到各復合物二級相對含量見表1。與對照蛋白相比，β-LG-EGCGGlc con的負橢圓率增大（β-折疊增至36.4%），而β-LGGlc-EGCG con的負橢圓率降低（β-折疊減少至32%）。同時由表1可知，這2 種共價復合物無規卷曲分別增加到34.6%和35.0%。Liu Fuguo等[21]發現乳鐵蛋白與綠原酸共價結合后再與葡聚糖共價結合，蛋白質的α-螺旋減少，并且無序結構增加。本實驗中β-LG-EGCG-Glc con的二級含量變化趨勢與Liu Fuguo等[21]研究結果一致。不同順序形成的非共價復合物的結構呈現相同的變化趨勢，β-LG-EGCG-Glc mix和β-LG-Glc-EGCG mix的β-折疊相對含量都增加，分別為36.2%和38.9%，無規卷曲相對含量則減少為27.8%和27.7%。

圖5 β-LG及其共價復合物和非共價復合物CD光譜分析Fig. 5 Circular dichroism (CD) spectra

表1 不同復合物的二級結構相對含量Table 1 Contents of secondary structures of different complexes%

2.6 三元復合物的功能性質測定結果

2.6.1 起泡性及起泡穩定性

表2 不同復合物的功能性質Table 2 Functional properties of different complexes

蛋白質的擴散能力、吸水及在空氣-水相界面展開重排的能力可以由起泡性能力表征[26]。由表2可知，共價復合物的起泡性比β-LG的起泡性大大提高，其中不同添加順序得到的共價復合物的起泡性差距明顯（P＜0.05），β-LG-Glc-EGCG con的起泡性為121.87%，遠高于β-LG-EGCG-Glc con（82.33%），不同添加順序對其共價復合物結構的影響與其功能性質的變化有關。而直接混合得到的不同添加順序的非共價復合物的起泡性雖較β-LG提高了10%左右，但非共價復合物兩者間的起泡性無明顯差別，熒光光譜和CD光譜結果表明不同添加順序得到的共價復合物結構相差較大，而非共價復合物相差較小，起泡性的實驗結果與之一致。此外，從起泡穩定性的研究結果可知，β-LG-Glc-EGCG con的起泡穩定性（64.57%）高于β-LG-EGCG-Glc con（54.20%），同時都遠高于β-LG，而非共價復合物β-LGEGCG-Glc mix、β-LG-Glc-EGCG mix的起泡穩定性分別為42.83%和48.73%。由此可知，EGCG和Glc及β-LG的復合物可以提高β-LG的起泡性及起泡穩定性，其中，β-LGGlc-EGCG con復合物起泡性及起泡穩定性效果最好，可能是因為β-LG-Glc-EGCG con復合物分子間的作用力較強，同時在溶液中的黏度最大，因此出現較好的穩定性[32]。

2.6.2 乳化性及乳化穩定性

乳化性的大小可以用作考量蛋白質協助穩定乳液能力的指標，而乳液維持其結構的能力可以用乳化穩定性來衡量[25]。如表2所示，復合物的乳化性均較β-LG有提高，其中，非共價處理得到的β-LG-EGCG-Glc mix、β-LG-Glc-EGCG mix乳化性分別為41.39%和41.86%，較高于共價處理得到的β-LG-EGCG-Glc con （32.45%）、β-LG-Glc-EGCG con（35.62%）。但從乳化穩定性結果可知，共價復合物的乳化穩定性高于非共價復合物。研究表明，蛋白質的乳化性不僅與表面疏水性有關，還與蛋白質的溶解度及粒徑有關[24,38]。陳豪等[39]研究發現不同提取方法也會對乳化性有不同的影響。

3 結 論

本研究通過2 種方法制備了β-LG、EGCG、Glc的三元復合物，并討論了不同的添加順序對復合物結構功能的影響以及共價與非共價復合物的區別。研究結果表明，不同添加順序對共價三元復合物影響較大，而對非共價復合物影響不明顯。4 種三元復合物的結構發生了不同程度的改變，共價復合物較于非共價復合物有更大的結構改變。其中，添加順序對共價復合物的結構影響較大，β-LG-Glc-EGCG con比β-LG-EGCG-Glc con有更低的熒光猝滅以及更高的疏水性。而對于非共價復合物，不同的添加順序對其影響不明顯。乳化性和起泡性功能性質結果表明共價復合物的功能性質優于非共價復合物，共價復合物中β-LG-Glc-EGCG con的功能性質均優于β-LG-EGCG-Glc con。而不同添加順序形成的非共價復合物沒有明顯差別。