大黃魚源腐敗菌的黏附特性與生物膜特性分析

張 雯，卞 丹，阮成旭，時祥柱，倪 莉,*

（1.福州大學食品科學技術研究所，福建省食品生物技術創新工程技術研究中心，福建 福州 350108；2.福建省新閩科生物科技開發有限公司，福建 福州 350008）

水體中的病原細菌可通過黏附魚鰓、魚體表和腸道定植魚體，并最終使其感染[1-2]。Van Den Abbeele等[3]發現不同細菌的黏附能力差異較大，Lee等[4]研究表明戊糖乳桿菌對腸黏液的黏附率顯著高于其他細菌。同時，研究發現細菌對黏液的黏附特性與菌體表面性質（包括菌體表面疏水性、自凝聚能力）等有關，Del Re等[5]研究證實雙歧桿菌的黏附性與其表面疏水性和自凝聚能力密切相關，具有較強疏水性和自凝聚能力的菌株具有更高的黏附能力；許女等[6]也通過實驗證明牛源乳酸菌的表面疏水性和其黏附性能呈正相關。大量研究表明細菌能在黏附于物體表面、氣液界面后生長繁殖，形成由菌體細胞和胞外分泌物如多糖、蛋白質和核酸等組成的膜狀結構，即生物膜。致病菌形成的生物膜會促進感染的發生，阻礙疾病的治療，而魚體腐敗菌形成的生物膜則可能污染加工設備，加速魚體的衰敗、變質。郭慶昕等[7]探究發現黏附能力強的銅綠假單胞菌，其生物膜形成能力也較強。龔虹等[8]研究表明乳酸菌的疏水性、自凝聚能力和生物膜形成能力有正相關關系，可作為菌體黏附能力的指標。此外，生物膜的形成也與多種環境條件相關，尹清干等[9]實驗表明培養時間、初始菌濃度、溫度、pH值及不同組織和黏液等各種環境因子均能顯著影響鰻弧菌生物膜的形成。

目前，國內外學者對乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌及一些致病菌的黏附能力、生物膜特性、疏水性等方面進行了較深入研究，而從黏附特性的角度研究魚體腐敗菌較少。希瓦氏菌和假單胞菌是引起冰鮮魚體腐敗變質的特定腐敗菌[10-13]。本研究以大黃魚源腐敗菌為研究對象，比較腐敗菌黏附差異，探究表面疏水性、自凝聚能力及生物膜形成能力與菌體黏附能力的相關性，并通過微孔板法探究時間、pH值、溫度、初始菌濃度等因素對其成膜的影響。這些研究將進一步明確魚源腐敗菌的腐敗機理，為保鮮劑的開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）MA1-5、MA1-7和MA1-13，假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）R3-1、R3-2和R3-5，分離自冰鮮大黃魚，本實驗室保存。

結晶紫 西隴化工股份有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養基 廣東環凱微生物科技有限公司；乙醇、甲醇、二甲苯、氯化鈉 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1100紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；CF16RXII冷凍高速離心機 日本Hitachi公司；SpectraMax i3+MiniMax多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌的活化與培養

希瓦氏菌和假單胞菌經斜面培養基活化后，劃線接種至牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養24 h。挑取1 環單菌落接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，28 ℃、200 r/min搖床培養過夜。

1.3.2 細菌表面疏水性測定

采用微生物黏著碳氫化合物（microbial adhesion to hydrocarbons，MATH）法[14]測定魚源腐敗菌的表面疏水性。細菌培養物經8 000 r/min離心10 min收集菌體，生理鹽水洗滌2 次，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，用生理鹽水重懸菌體沉淀，并調節菌懸液濃度，使其A600nm為1.0±0.05。吸取2 mL細菌懸液和2 mL二甲苯渦旋混合2 min，于室溫靜置30 min。待其分層，取1 mL水相，測其A600nm，每組平行3 管，以生理鹽水為空白對照組。表面疏水率計算如式（1）所示：

式中：A0和A1分別為與二甲苯混勻前后水相吸光度。

1.3.3 菌株自凝聚能力測定

參考Rahman等[15]方法測定細菌自凝聚能力，細菌培養物經8 000 r/min離心10 min收集菌體，生理鹽水洗滌2 次，8 000 r/min離心10 min后，棄上清液，用生理鹽水重懸菌體沉淀制備菌懸液，使菌懸液A600nm為1.0±0.05。吸取4 mL菌懸液置于10 mL試管中，室溫靜置，分別于1、2、3、4、5 h后吸取1 mL上層溶液測定A600nm，分別記作A1、A2、A3、A4、A5，每組每個時間點平行3 管。自凝聚率計算如式（2）所示：

式中：A0和At分別為自凝聚前后上層溶液吸光度。

1.3.4 細菌黏附能力的測定

采用Vinderola等[16]方法對細菌進行熒光標記，參照Larsen等[17]的方法收集大黃魚體表、魚鰓和魚腸部位黏液，以福林-酚法測定蛋白質質量濃度，并調節至0.5 mg/mL，分裝保存于-20 ℃冰箱。取體表、魚鰓和魚腸黏液各150 μL加入96 孔酶標板中，4 ℃包被過夜。棄去未結合黏液，用200 μL無菌0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗2 次，加入150 μL異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的菌懸液，4 ℃孵育120 min。用無菌生理鹽水清洗2 次除去未黏附的細菌，再加入150 μL 1%十二烷基硫酸鈉（0.1 mol/L NaOH）溶液于60 ℃培養箱中釋放裂解1 h，多功能酶標儀上檢測，每組重復9 孔，以1%十二烷基硫酸鈉為空白對照，通過熒光強度按式（3）計算細菌黏附率。多功能酶標儀參數設置：激發光波長：495 nm；發射光波長：525 nm；光學位置：bottom；每孔樣品檢測次數：12 次。

式中：FI2為實驗組的熒光強度；FI1為FITC標記的純菌懸液的熒光強度。

1.3.5 細菌生物膜的檢測

參考Djordjevic等[18]微孔板法并適當修改。魚源腐敗菌過夜培養后，與新鮮TSB按1∶1 000稀釋混勻，取200 μL加至96 孔酶標板孔中，28 ℃靜置培養24 h后棄去培養液，用200 μL 0.85%無菌生理鹽水輕柔清洗2 次，除去游離菌，室溫下干燥。每孔加入200 μL 0.1%結晶紫溶液，室溫染色15 min后棄去染液，去離子水清洗5 次。完全干燥后，加入200 μL 95%乙醇溶液，待結晶紫充分溶解后，吸取100 μL放于全新96 孔板中，用多功能酶標儀檢測A590nm。每組設置9 個平行，以無菌TSB為空白對照。

1.3.6 不同因素對生物膜形成特性的影響

1.3.6.1 培養時間對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

以希瓦氏菌MA1-7為魚源腐敗菌代表，測定不同因素對細菌生物膜形成的影響。將生物膜培養時間分別設置為6、12、24、30、36、48、54、60、72 h，按1.3.5節方法測定生物膜形成情況。

1.3.6.2 菌濃度對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

用TSB培養液配制終密度為108CFU/mL的菌懸液，10 倍系列梯度稀釋法依次得到107、106、105、104、103、102CFU/mL的菌懸液，按1.3.5節方法測定生物膜形成情況，探究初始菌濃度對生物膜形成的影響。

1.3.6.3 溫度對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

TSB肉湯培養液配制終密度為106CFU/mL的菌懸液，分別在4、10、20、28、37、45 ℃條件下靜置培養24 h，按1.3.5節方法測定生物膜形成情況。

1.3.6.4 pH值對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

分別用pH 3、4、5、6、7、8、9、10的TSB培養液配制菌濃度為106CFU/mL的菌懸液，按1.3.5節方法測定生物膜形成情況。

1.3.6.5 NaCl質量分數對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

分別配制NaCl質量分數為0.5%、0.8%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、6%的TSB培養液，以此制備菌懸液，按1.3.5節方法探究NaCl質量分數對魚源腐敗菌生物膜形成的影響。

1.3.6.6 不同部位黏液對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

分別取體表、魚鰓和魚腸黏液200 μL加入96 孔板中，4 ℃過夜包被，棄去未結合黏液，用無菌生理鹽水清洗2 次，按1.3.5節方法測定生物膜形成情況，以未經黏液包被的96 孔板作為對照。

1.4 數據分析

結果以 ±s表示，采用GraphPad Prism 6.0繪圖，SPSS 22.0的Duncan檢驗進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 細菌表面疏水性和自凝聚能力分析

菌體表面疏水作用和自凝聚能力是細菌非特異性黏附到各種生物和非生物表面及界面的重要理化作用力，被認為是細菌與宿主間相互作用的因素之一，且與其特異性黏附相關[14]。本研究通過疏水性細菌易聚集到水-油界面這一特點，采用二甲苯測定各菌株的疏水性。圖1表明，不同魚源腐敗菌的表面疏水性存在高度差異性，疏水率由弱至強依次為R3-2、MA1-5、R3-1、R3-5、MA1-7、MA1-13，其中希瓦氏菌MA1-13的表面疏水性顯著高于其他菌株，假單胞菌R3-2顯著低于其他菌株。MATH法[19]中菌株疏水率大于50%為高疏水性，小于20%為非疏水性，由此可知魚源腐敗菌MA1-13、MA1-7、R3-5和R3-1為高疏水性菌株，而不存在非疏水性菌株。比較兩屬細菌發現，希瓦氏菌屬的表面疏水性強于假單胞菌屬。疏水作用的強弱取決于細菌表面非極性基團的數量，與菌體表面蛋白、菌毛、莢膜等附著器有關，因此不同屬細菌表面疏水性存在差異性。圖2中魚源腐敗菌的自凝聚能力隨著靜置時間的推移而顯著增強，且菌株間自凝聚率具有明顯差異，自凝聚能力由弱至強依次是R3-5、R3-1、R3-2、MA1-5、MA1-7和MA1-13，其中希瓦氏菌MA1-7和MA1-13的自凝聚能力最強，希瓦氏菌MA1-5在靜置1 h時的自凝聚能力較弱，但之后隨著時間的推移，迅速提高。假單胞菌屬的自凝聚能力則明顯弱于希瓦氏菌屬。

圖1 希瓦氏菌和假單胞菌的表面疏水性Fig. 1 Surface hydrophobicity of Shewanella and Pseudomonas

圖2 希瓦氏菌和假單胞菌的自凝聚能力Fig. 2 Auto-aggregation ability of Shewanella and Pseudomonas

細菌表面疏水性及自凝聚能力兩個指標的比較中，希瓦氏菌強于假單胞菌。細菌黏附分為兩階段，第1階段為聚集和吸附，細菌接近黏膜上皮細胞發生非特異性結合；第2階段為特異性受體與細菌發生特異性結合過程。細菌表面性質如疏水性和自凝聚能力則在第1階段發揮作用，有助于細菌聚集形成生物膜并在宿主表面定植和感染，可以推測希瓦氏菌在魚體黏附能力上將更強于假單胞菌。

2.2 細菌黏附能力分析

魚源腐敗菌黏附于宿主是其侵襲和致腐的先決條件，細菌定植后，才可在該部位大量繁殖，產生代謝物或毒素進攻宿主。探究希瓦氏菌和假單胞菌對大黃魚黏液的黏附能力差異，圖3表明不同細菌的黏附能力不同，對魚體不同部位黏液的黏附能力也顯著不同。就菌株而言，希瓦氏菌MA1-5和MA1-7對各部位的黏附能力均強于其他菌株（P＜0.05），3 株假單胞菌的黏附能力無明顯差異（P＞0.05）。Chen Qiang等[20]表明溶藻弧菌對大黃魚黏液的黏附取決于細菌表面結構，不同的黏液成分影響細菌的黏附作用強弱。細菌黏附過程由細菌表面的黏附素和黏液中的特異性受體共同完成，而黏附素包括糖蛋白、脂多糖、外膜蛋白等。因此細菌對不同黏液的黏附能力具有差異性，與其對黏液的宿主特異性及細菌自身的黏附素都有關[8]。從黏液部位分析，細菌對魚腸黏液的黏附能力顯著低于其對魚鰓黏液和體表黏液的黏附能力（P＜0.05）；不同腐敗菌對魚鰓黏液的黏附能力均強于其他黏液，說明魚鰓是魚在環境中攜帶細菌最重要的場所，魚鰓對腐敗菌的黏附可能在魚體腐敗和保鮮中扮演重要的角色。致病弧菌對大黃魚的黏附作用研究中，同樣發現其對魚鰓黏液有較高的黏附量[1]。

圖3 希瓦氏菌和假單胞菌的黏附能力Fig. 3 Adhesion ability of Shewanella and Pseudomonas

2.3 細菌生物膜形成能力分析

生物膜是指細菌黏附于物體或組織表面時形成的含有微菌落及其胞外分泌物的基質層，它能增強細菌對外環境的抵抗力[21]，因此腐敗菌生物膜形成能力越強，則其抵御能力越強，導致魚體腐敗越嚴重。通過微孔板法測定各腐敗菌的生物膜形成能力，圖4表明不同腐敗菌形成生物膜的能力顯著不同，希瓦氏菌強于假單胞菌。希瓦氏菌MA1-7是6 株大黃魚源腐敗菌中生物膜形成能力最強的；其次是MA1-5和MA1-13，兩者形成生物膜的能力無顯著差異；而假單胞菌R3-5最弱。結果表明腐敗菌的黏附能力與成膜能力存在一定的一致性。任真真[22]的研究認為以生物膜形成情況可用于評估乳酸菌的黏附能力，這都說明細菌的生物膜形成能力與其黏附作用息息相關。

圖4 希瓦氏菌和假單胞菌的生物膜形成能力Fig. 4 Biofilm formation ability of Shewanella and Pseudomonas

2.4 細菌黏附特性相關指標的相關性分析

以6 株魚源腐敗菌的表面疏水性、自凝聚能力、黏附能力及生物膜形成能力為因素，用皮爾遜相關系數表示黏附特性與黏附能力之間的相關性，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析探究希瓦氏菌屬和假單胞菌屬在黏附作用上的差異。

表1 黏附能力與黏附特性間皮爾遜相關性分析Table 1 Correlation of adhesive ability with adhesive properties using Pearson correlation coefficient

對不同部位黏液黏附能力與黏附特性指標進行相關性分析，通過表1可看出，菌體對魚腸黏附性與自凝聚能力和生物膜形成能力具有較高的相關性，對體表黏附性只與生物膜形成能力有關，對魚鰓黏附性與表面疏水性、自凝聚能力和生物膜形成能力都具有一定的相關性。

圖5 希瓦氏菌和假單胞菌的黏附特性的PCAFig. 5 PCA plot of adhesion characteristics of Shewanella and Pseudomonas

圖5 中F1和F2累計方差貢獻為82.68%，能反映出大部分信息，說明通過PCA可較好地區分腐希瓦氏菌屬和假單胞屬的黏附能力差異。希瓦氏菌屬細菌聚集F1軸正坐標，假單胞菌屬細菌F1負坐標，說明假單胞菌和希瓦氏菌在黏附特性上具有顯著差異，可通過4 個指標可不同菌屬區分開。同時，假單胞菌間聚集度高于希瓦氏菌屬，這也表明假單胞菌屬細菌在黏附特性上具有更多的相似性。

圖6 基于黏附特性的希瓦氏菌和假單胞菌聚類分析Fig. 6 Clustering analysis of adhesion characteristics of Shewanella and Pseudomonas

由聚類分析結果（圖6）可知，取閾值為6時，細菌以4 項指標可分為3 類，即I類（R3-1、R3-5、R3-2）、II類（MA1-13）、III類（MA1-5、MA1-7）。這說明假單胞菌屬細菌間的黏附作用相近，希瓦氏菌屬細菌MA1-5和MA1-7能力相近，而與MA1-13有一定差異。這與PCA有一定相似性，PCA中MA1-13距離MA1-5和MA1-7較遠，MA1-13表現出更強的表面疏水性，但表面疏水性與黏液黏附性沒有高的相關性，因此在黏附能力上，較MA1-5和MA1-7弱。

2.5 不同因素對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

2.5.1 培養時間對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

圖7 培養時間對希瓦氏菌生物膜形成的影響Fig. 7 Effect of culture time on biofilm formation of Shewanella

由圖7可知，培養時間對魚源腐敗菌形成生物膜有顯著影響。培養6 h時細菌增長繁殖但還未聚集，而12 h觀察到細菌開始在培養基表面聚集，生物膜開始形成，呈現易被破壞的細條狀。12～24 h培養期間，生物膜量逐漸增加；在36 h達到最大值，并維持至54 h，該階段生物膜形成量無顯著差異；54 h之后生物膜量開始下降，厚度逐漸降低。Stoodley等[23]認為生物膜的形成是一個動態過程，經歷形成、成熟和老化3 個階段，Lin Shiqi等[21]則是將形成期再分成初始附著期和早期發展期。根據本研究結果，腐敗菌生物膜的形成可分為形成期0～36 h，成熟期36～54 h，老化期60～72 h。細菌黏附后，產生的不溶性多糖有助于其群體間的聚集，生物膜三維結構逐漸形成，厚度顯著增加。但進入成熟期后，培養基中的營養成分消耗，且代謝物累積，菌體生長受到限制；老化期時，生物膜上的細菌活性降低，胞外多糖量減少，生物膜開始脫落、減少[24-25]。

2.5.2 初始菌濃度對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

圖8 希瓦氏菌初始菌濃度對細菌生物膜形成的影響Fig. 8 Effect of initial bacterial concentration on biofilm formation of Shewanella

圖8 表明，隨著細菌初始菌濃度（102～106CFU/mL）的提高，其生物膜形成量顯著增加。但達到106CFU/mL后，即使濃度增加，生物膜的形成結果無顯著差異，即濃度達到一定值后對生物膜形成無顯著影響。細菌黏附到接觸面后便利用環境中的營養成分生長繁殖，適當的菌體濃度可加速生物膜的形成[24]；當細菌增殖達到一定濃度，環境中的營養物質被消耗完全，細菌生長被抑制，從而導致生物膜的形成受到抑制。

2.5.3 培養溫度對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

圖9 培養溫度對希瓦氏菌生物膜形成的影響Fig. 9 Effect of incubation temperatures on biofilm formation of Shewanella

微生物在適宜溫度下進行生長繁殖和代謝活動，因此細菌生物膜的形成與培養溫度密切相關。圖9表明，溫度在4～20 ℃之間時，由于細菌處于不適宜溫度下，生長緩慢，幾乎不形成生物膜，此期間溫度對成膜無顯著影響（P＞0.05）。而在20～37 ℃范圍內，隨著溫度的升高，細菌生物膜形成量顯著增加，且在37 ℃達到最大值。37～45 ℃，溫度繼續升高，生物膜形成量顯著下降，這可能是細菌不耐受高溫或胞外酶類失活導致。有研究認為高溫抑制鞭毛的生成，而鞭毛與生物膜形成有關[25]。溫度對鰻弧菌[5]、溶藻弧菌[24]等都具有相似的影響。

2.5.4 pH值對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

圖10 pH值對希瓦氏菌生物膜形成的影響Fig. 10 Effect of pH valus on biofilm formation of Shewanella

圖10 表明，生長環境的pH值顯著影響魚源腐敗菌的生物膜形成情況。pH值在3～4時為強酸性環境，不利于細菌生物膜的形成，A590nm顯著低于其他組。pH值從4升到7的過程中，酸性逐漸減弱至中性，魚源腐敗菌的生物膜形成能力顯著增強，并在pH 7時達到最大值。隨后，pH值從8繼續升高至10，堿性慢慢增強，A590nm迅速減小，即細菌的生物膜形成量顯著下降。由此猜測在強酸性和強堿性環境中，魚源腐敗菌的活性可能受到抑制，從而導致生物膜形成能力也受到阻礙。

2.5.5 NaCl質量分數對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

圖11 NaCl質量分數對希瓦氏菌生物膜形成的影響Fig. 11 Effect of of NaCl concentration on biofilm formation of Shewanella

圖11 顯示，NaCl質量分數對魚源腐敗菌生物膜的形成有顯著影響。當NaCl質量分數為0.8%時，希瓦氏菌生物膜的形成量最多，此后隨著質量分數增大，生物膜形成量顯著下降。這說明低濃度NaCl會促進希瓦氏菌生物膜的形成，其主要原因是Na+可驅動端鞭毛的運動，從而促進生物膜的形成[26]，而高濃度NaCl溶液卻抑制細菌生物膜的形成。研究發現當NaCl質量分數為1.5%時，希瓦氏菌生長速率最大[27]，而本結果中該質量分數下的生物膜量僅次于最適濃度下的形成量。希瓦氏菌可在較高鹽條件下生長，這可能是其在NaCl質量分數3%～6%條件下仍可形成生物膜的原因。陸文偉等[28]探究雙歧桿菌生物膜的成膜規律，發現其對氯化鈉、硫酸鎂等離子具有一個最適濃度；副溶血性弧菌在NaCl質量分數2%時形成生物膜能力最強，但當其在NaCl和葡萄糖混合溶液中時，其生物膜的形成受葡萄糖濃度的調控[29]。

2.5.6 不同部位黏液對希瓦氏菌生物膜形成影響

圖12 不同部位黏液對希瓦氏菌生物膜形成的影響Fig. 12 Effect of fish mucus type on biofilm formation of Shewanella

魚源腐敗菌對不同部位大黃魚黏液的黏附能力不同，進一步探究不同部位的黏液對細菌形成生物膜的影響。如圖12所示，與對照組正常TSB培養基中形成的生物膜量相比，包被黏液后的實驗組生物膜量產生顯著差異。當96 孔板包被魚腸黏液和體表黏液后，希瓦氏菌形成的生物膜量低于對照組，但包被魚鰓黏液后，生物膜量顯著高于對照。此部分結果與菌體對魚體黏液層黏附能力具有對應關系。黏附實驗表明魚源腐敗菌對魚鰓黏液的黏附能力最強，而腐敗菌對魚腸和體表黏液的黏附能力較弱。黏液層是生物體防御機制的重要組成部分，體表和魚腸黏液可能含有某些抑菌成分，在一定程度上抑制細菌繁殖、分泌胞外多糖等，從而降低生物膜的形成量。由此可以推測，魚體表和魚腸黏液可能存在某些因素，抑制腐敗菌的黏附與生物膜的滋生。

3 結 論

希瓦氏菌屬比假單胞菌屬具有更強的對海水魚體黏液的黏附能力，同時具有很好的生物膜形成能力。黏附能力與自凝聚能力和生物膜形成能力有較高的相關性。希瓦氏菌的生物膜形成受初始菌濃度、培養時間、溫度、pH值、鹽含量等多種環境因素影響。希瓦氏菌在初始菌濃度大于106CFU/mL、37 ℃、pH 7～8、0.8% NaCl時形成的生物膜量最多；生物膜在12～24 h期間快速形成，并在36 h達到峰值后，隨培養時間延長而逐漸下降。大黃魚黏液對腐敗菌的黏附和成膜都具有一定程度的影響，魚腸黏液對菌體的黏附性最小，對生物膜形成具有抑制作用，而魚鰓黏液對菌體的黏附性最高，對生物膜形成具有促進作用。希瓦氏菌和假單胞菌是常見的魚體腐敗菌，但不同水域、不同種類的魚體中特定腐敗菌種類不同、比例不同。深入了解腐敗菌在魚體的黏附、定植、成膜，并取得腐敗優勢的成因，是解釋魚體腐敗機理的一個重要途徑。