IKnife-REIMS聯用技術對南極犬牙魚脂質組學輪廓檢測

陳 康，王海星，張燕平，李詩言，王 揚，饒 偉，沈 清,*

（1.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室，浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2.浙江省麻醉重點實驗室，溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院，浙江 溫州 325000；3.浙江省水產質量檢測中心，浙江 杭州 310023；4.沃特世科技（上海）有限公司，上海 200126）

南極犬牙魚（Dissostichus eleginoides），亦稱美露鱈、南極鱈魚，屬輻鰭魚綱、鱸形目、南極魚科、南極犬牙魚屬，主要分布在南美、澳洲以及次南極區群島海域，生存水域深及2 500 m，以少骨和肉質白嫩晶瑩剔透而聞名[1-2]。犬牙南極魚屬的經濟價值比較高，目前的市場平均價格高于金槍魚，被稱為“白金漁業”[3]。對南極犬牙魚資源的商業開發和利用，國際上自20世紀70年代中期開始至今約40年的歷史[4]。我國受條件限制，還未進行實際的漁業捕撈生產，國內也鮮見其漁業資源和加工利用方面相關報道。

脂質組學通過系統分析細胞、體液、組織等脂質及其代謝物，識別關鍵的脂生物標志物，反映生物種間差異或特定條件下脂質的整體變化[5]。目前，脂質組學的分析方法主要有薄層色譜法、氣相色譜-質譜聯用、軟電離質譜技術、核磁共振法等[6-10]。基于電噴霧離子化的“鳥槍法”和正相或親水色譜質譜聯用法是脂質組學常用的分析方法[11-12]。然而，目前的脂質組學質譜方法對樣品前處理要求較高，步驟較為復雜，無法滿足研究人員對快速、高通量、實時檢測的需求。

快速蒸發離子化質譜（rapid evaporative ionization mass spectrometry，REIMS）技術是一種無需制備或液相色譜分離的新型原位電離質譜技術，使用iKnife、電熱探頭等手持采樣裝置直接蒸發樣品表面，產生信息豐富的氣溶膠并通過離子傳輸管路進入質譜質量分析器，數秒內提供分析物的準確分子質量譜[13-14]。以REIMS為基礎的生物組織分析無須任何樣品前處理，通常僅需幾秒鐘的時間即可完成數據采集與分析并實現生物組織識別，精確度達到90%～98%[15]。目前，REIMS已經成功應用于臨床組織切除、腫瘤診斷、微生物鑒定、食品鑒別等，為脂質組學研究提供了一種全新的研究方法和研究思路[16-18]。國內已有媒體介紹REIMS的新聞通訊，但鮮見相關技術研究報道。

本實驗基于REIMS技術，使用iKnife電切南極犬牙魚肌肉組織，使其表面脂質快速蒸發并進入質譜檢測，獲得脂質組學輪廓圖譜并進行結構鑒定和相對定量。由于目前國內鮮見REIMS相關研究報道，研究成果可促進REIMS理論與技術發展，拓寬其在生命科學、食品科學等研究領域的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極犬牙魚組織切片樣品 浙江大洋世家股份有限公司。

甲醇、乙腈、丙二醇（均為色譜純） 美國Merck公司；亮氨酸腦啡肽 美國Sigma公司；實驗用水為經Millipore超純水儀制備的超純水。

1.2 儀器與設備

Xevo G2-XS四極桿飛行時間質譜儀（配有iKnife手持采樣裝置） 美國Waters公司；Pump11 elite針泵注射進樣器 美國Harvard公司；Milliplus 2150超純水處理系統 美國Millipore公司。

1.3 質譜條件

iKnife質譜技術兩大突出優勢為動態實時和無需樣品前處理，本實驗的南極犬牙魚樣品0 ℃冰水解凍后即可直接檢測。使用iKnife電刀切割南極犬牙魚組織切片表面，生成含有大量復雜離子混合物的氣溶膠，經Venturi泵氮氣驅動，采用正交方式經PTFE管引入質譜端口后與Kanthal A1燈絲（1.1 ?，3 V，500 ℃）碰撞，隨后脂質離子進入質譜儀StepWave裝置并有質量分析器檢測分析，實驗裝置如圖1所示。以丙二醇-亮氨酸腦啡肽混合物為輔助溶劑，經針泵注射進樣器以0.1 mL/min的流量引入端口，用于清洗雜質、提高信號強度、鎖定質量校正；質譜儀掃描時間為1 s；質量掃描范圍為m/z 100～1 200；所有數據均以負電離模式收集。

圖1 基于iKnife直接采樣南極犬牙魚獲取脂質組學輪廓的REIMS設備裝置圖Fig. 1 Setup of iKnife based REIMS for lipidomic profiling of Patagonian toothfish

1.4 數據處理

將質譜圖經MassLynx進行峰匹配、濾噪、中心化和質量校準處理，結果保存為txt格式。根據質譜數據得到主要離子峰的m/z和峰面積信息，結合高豐度離子二級質譜碎片、Lipid MS Predictor和LipidMap脂質分子數據庫比對確定或推測脂質的結構信息，部分低豐度離子二級質譜信號較弱，因此結構未能完全確認。數據采集軟件Masslynx 4.1和統計分析軟件LiveID由美國Waters公司提供。

2 結果與分析

2.1 iKnife離子化條件優化

南極犬牙魚肌肉組織低脂特性對REIMS檢測結果的影響較大。前期實驗研究發現，iKnife在電切禽畜類肌肉或內臟組織時，離子信號響應較強、信噪比較高；電切魚類組織，尤其是犬牙魚等低脂魚類肌肉組織時，脂質離子較難被檢測到，噪音影響顯著。因此，首先對iKnife電切條件進行優化，調整輸出功率、切割速率、切割長度，以獲得穩定、可靠的南極犬牙魚肌肉組織脂質組學輪廓圖譜。

表1 響應面試驗設計方案及結果Table 1 Experimental design and results for RSM

使用響應面法優化試驗參數，以Box-Behnken設計原理，選取磷脂離子母峰m/z 885.55的信噪比作為響應值，輸出功率、切割速率、切割長度為試驗因素，設計優化不同試驗條件組合，結果如表1所示。

利用Design Expert 8.0軟件對表1中的試驗數據進行回歸分析及擬合，得到的信噪比回歸方程為：

Y=46.44+0.19A-0.30B+0.51C+1.87AB-0.6AC+0.47C-2.07A2-2.84B2-3.47C2

由表2方差結果得出模型（P＜0.000 1）極顯著，失擬項（P＝0.160 4）不顯著，R2為0.976 6，該回歸方程與實際數據擬合度較高。

根據圖2所示的3 個因素響應面與等高線圖，最優化分析后得出最佳提取條件為輸出功率25.08 W、切割速率0.49 mm/s、切割長度1.03 cm，信噪比預測值為46.465 6。為便于實際操作，將實驗條件調整為：輸出功率25 W、切割速率0.50 mm/s、切割長度1.0 cm。在最佳條件下進行5 次重復實驗，驗證得到實際信噪比平均值為46.32，此優化條件有效。

表2 回歸方程參數方差分析Table 2 Analysis of variance of regression equation

圖2 m/z 885.55信噪比的響應面及等高線圖Fig. 2 Response surface and contour plots showing the interactive effect of instrumental parameters on the signal-to-noise ratio of m/z 885.55

2.2 脂肪酸離子分析

圖3 m/z 200～400 脂肪酸離子REIMS圖Fig. 3 REIMS spectra of fatty acid ions in the m/z range from 200 to 400

使用iKnife手持采樣的REIMS技術無需任何樣品前處理，通過對組織樣品表面離子化，實時獲得質譜輪廓圖，經LiveID等軟件識別，并對特征離子峰降維、建模后，可實現未知樣品的實時鑒定與準確度評分。由于前端并未串聯液相色譜等分離技術，目前REIMS相關研究主要以定性為主。因此，本實驗研究目的主要為獲得低脂魚類南極犬牙魚的脂質組學輪廓圖，對各脂質分子的絕對含量定量方法未做深入研究。

表3 南極犬牙魚中脂肪酸的相對含量及結構解析Table 3 Relative contents and probable attributions of fatty acids in D. eleginoides

通過對南極犬牙魚肌肉組織進行電切離子化，掃描范圍m/z 100～1 200，同時以亮氨酸腦啡肽（m/z 554.261 5）為內標鎖定質量并校準質量軸。如圖3所示，區域內離子較多，且基質噪音也較為明顯；通過對其鑒定和積分，得到結構和相對含量見表3。脂肪酸離子特征表現為，根據偶氮規則，其在質譜圖中質量數通常為奇數。實驗共檢出脂肪酸離子17 種，其中信號響應強度最大的為m/z 327.23，相對含量達到了17.81%，經鑒定其結構為FA 22∶6，即所熟知的DHA。其次分別為m/z 255.23（FA 16∶0，9.81%）、m/z 281.25（FA 18∶1，9.09%）。m/z 375、389等疑似為超長鏈脂肪酸FA 24∶3 Ep（2.79%）、FA 26∶3（2.96%），其存在可能與南極犬牙魚受極寒環境脅迫，促使其代謝產生長鏈脂肪酸以提高體液流動性相關[19]；相關假設尚需生物學進一步驗證。

2.3 磷脂離子分析

對質譜圖4降噪、去同位素等處理，篩選峰面積大于3.00×105的離子峰，根據其分子質量測定值推算其可能的化學結構，并使用二級質譜進行驗證。以m/z 883.53為例，其離子質量與磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）離子[PI 38∶5-H]-（C47H80O13P-，883.534 2）最為接近，通過子離子掃描將母離子解離得到，可觀察到由m/z 883.53斷裂的脂肪酸鏈子離子m/z 283.2（FA 18∶0）和m/z 301.1（FA 20∶5），碳原子數和雙鍵數與前期推測38∶5吻合，故此可確認m/z 883.53為[PI 38∶5-H]-。通過這種方法可對大多數磷脂離子結構進行確認，部分低豐度離子因為子離子信號響應不足未做二級質譜確認。南極犬牙魚肌肉組織中共鑒定磷脂離子峰10 種，質量范圍m/z 736.49～909.55，根據峰面積采用歸一化法計算相對豐度，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為3.28%～6.21%。信號最強離子峰m/z 885.55經鑒定為[PI 38∶4-H]-，相對豐度達到了19.30%；其次為磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）離子m/z 790.54（[PE 40∶6-H]-），相對豐度為15.24%。通常魚類組織中磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）含量最高，PE次之，PI、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）的含量相對較少[20-21]。然而本實驗中PC和PE分子檢出較少，原因可能是iKnife輸出能量較高，電切過程中通過電能傳輸導致PC丟失膽堿基團，PE丟失氨基基團，最終生成磷脂酸（phosphatidyl acid，PA）離子[PA-H]-[22]。該推論印證了結果中較多[PA-H]-離子的檢出，如m/z 747.50（[PA 40∶6-H]-）、m/z 763.56（[PA O-42∶5-H]-）等。Balog等[23]使用iKnife-REIMS聯用技術對牛肉、馬肉等動物肌肉組織進行脂質輪廓分析，檢出的脂質同樣以PE、PA、PI為主。

圖4 m/z 650～1 000磷脂離子REIMS圖Fig. 4 REIMS spectra of phospholipid ions in the m/z range from 650 to 1 000

表4 南極犬牙魚中磷脂的相對含量及結構解析Table 4 Relative contents and probable attributions of phospholipids in D. eleginoides

2.4 方法學驗證

為驗證本實驗基于REIMS的南極犬牙魚脂質組學輪廓方法的可靠性，選取主峰脂肪酸離子m/z 281.25、m/z 327.24和磷脂離子m/z 790.54、m/z 885.55為特征脂質離子峰對靈敏度、選擇性、精確度等參數進行方法學驗證[24]。對由于組織樣品無法構建標準逐級稀釋體系，本實驗采用目標脂質信噪比為指標研究方法靈敏度。研究結果（表5）顯示，目標脂質的信噪比為35.4～95.3，方法靈敏度較高，鑒于南極犬牙魚為低脂魚類，對于脂質含量更高的中脂、高脂魚類理論上同樣適用。通過計算目標離子的實際測量值和理論值的偏差確定高分辨質譜的選擇性，目標脂質離子的偏差為4.17×10－6～9.78×10－6，表明方法分辨率高、選擇性較好，使用相對分子質量對脂質結構鑒定具有較大的指導意義。方法精密度通過日內和日間精密度測量，使用iKnife連續平行切割南極犬牙魚肌肉組織5 次，并計算目標脂質離子峰面積的RSD，得到日內精密度；以相同實驗條件連續平行測試7 d，計算RSD獲得日間精密度。其中日內精密度的RSD為3.7%～5.6%，日間精密度的RSD為5.9%～7.3%，本實驗方法精密度好，檢測結果穩定。

表5 REIMS南極犬牙魚脂質組學輪廓檢測方法驗證Table 5 Validation of REIMS method for lipidomic profiling of D. eleginoides

3 結 論

建立了iKnife和REIMS聯用技術用于檢測南極犬牙魚的脂質組學輪廓。通過響應面優化各項參數后，實現了低脂肌肉組織中脂質的離子化，成功檢出17 種脂肪酸離子和10 種磷脂離子。目前該技術尚處于研究探索階段，產生的脂質組學輪廓中，根據各個磷脂分子離子峰的強弱經歸一化法處理后反映了不同磷脂分子的相對含量情況，對建立魚類脂質的特征指紋譜圖具有重要意義。該方法無需樣品前處理，可實現南極犬牙魚肌肉組織脂質組學輪廓的實時檢測，方法選擇性、靈敏度、穩定性均較優，為脂質組學研究提供了新的技術手段。