羊肚菌揮發(fā)性物質綜合評價和品質差異分析

蘭秀華，謝麗源*，許瀛引，彭衛(wèi)紅，甘炳成

（1.四川省農業(yè)科學院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.電子科技大學生命科學與技術學院，信息生物學研究中心，四川 成都 610054）

羊肚菌（Morchella spp.），隸屬子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、羊肚菌科（Morchellaceae），羊肚菌屬（Morchella）[1]，是一種珍稀名貴食（藥）用菌，由于其菌蓋表面有不規(guī)則多面凹陷皺褶似羊肚而得名。羊肚菌味道鮮美，肉質脆嫩可口，風味獨特，是食（藥）用菌中的珍品之一，自古以來一直被奉為宴席上的美味佳肴。除此之外，羊肚菌營養(yǎng)豐富，含有多糖、生物酶類以及鈣、鋅、鐵等多種礦物質[2-3]。已有醫(yī)學研究表明，羊肚菌有調節(jié)機體免疫力、抗疲勞、抑制腫瘤、抗菌、抗病毒、降血脂、抗氧化等功效[4-12]。

近年來，羊肚菌馴化栽培技術得到迅猛發(fā)展，課題組通過10多年努力，選育了國內外首個羊肚菌新品種，集成了羊肚菌配套栽培技術研究，率先實現了羊肚菌大田商業(yè)化栽培，為羊肚菌市場提供商品來源。隨著羊肚菌人工栽培技術日益成熟，羊肚菌品種日益增多，目前對羊肚菌品種選育大多以外觀作為品質標準，以產量作為品種選育指標，并以此來指導生產。羊肚菌中含有獨特的香氣物質，它是賦予羊肚菌風味的關鍵因子，也是衡量其品質和品種選育的重要指標。目前國內外對于羊肚菌研究主要集中在菌株生物學特性[13-16]、深層發(fā)酵工藝優(yōu)化[17-18]、多糖提取及純化[19-22]、種質資源與遺傳多樣性[23-27]以及生物活性[28]等方面，關于羊肚菌香氣物質及品質區(qū)分方面的研究鮮有報道。

揮發(fā)性物質目前可通過感官評價、主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（cluster analysis，CA）進行分析鑒定和分類研究。感官評價方式存在極大的人為因素影響，而PCA和CA是近些年用于樣品之間區(qū)別和聚集最普遍的方式。利用PCA和CA進行羊肚菌品質的綜合評價，可避免單一指標的片面性和不穩(wěn)定性，為樣品的利用和品質育種提供重要的科學依據。

本實驗采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法檢測20 個樣品揮發(fā)性物質，分析揮發(fā)性物質特性，并對揮發(fā)性物質的相對含量進行PCA和CA，旨在為品種選育和后期生產加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

20 個羊肚菌子實體，編號為樣品1～20，均為梯棱羊肚菌（Morchella importuna）由四川省農業(yè)科學院土壤肥料研究所2017年馴化栽培，于同一栽培地點、同一管理栽培模式、同一時期采收樣品，經過挑選、烘干，粉碎后密封待用。

1.2 儀器與設備

7890-5975 GC-MS聯(lián)用儀（配有電子電離源）美國Agilent公司；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取纖維頭 美國Supelco公司；Atomx動態(tài)頂空自動進樣器 美國Teledyne Tekmar公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME

將粉碎后的樣品混合均勻，稱取2.00 g試樣放置在10 mL樣品瓶中，加入1.5 g NaCl和6 mL經過煮沸冷卻的蒸餾水，搖勻，然后將溶液置于15 mL頂空瓶中，將老化后的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入GC進樣口，于250 ℃解吸3 min，用于GC-MS分析檢測。

1.3.2 GC-MS條件

DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.50 μm）；載氣：高純氦氣；載氣流速（恒流模式）：1.0 mL/min；進樣口溫度：230 ℃；進樣方式：分流進樣；分流比：10∶1；升溫程序：35 ℃不保持，以5 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持10 min；離子源溫度：230 ℃；掃描模式：Scan；質量掃描范圍45～350 u；接口溫度：230 ℃；

1.4 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 22.0對羊肚菌揮發(fā)性物質進行PCA和CA。

2 結果與分析

2.1 不同羊肚菌樣品揮發(fā)性物質的比較

通過GC-MS分析，共鑒定出81 種揮發(fā)性物質，包含8 類揮發(fā)性物質：醛類、酮類、酯類、酸類、醇類、雜環(huán)類、烴類及其他。由表1可知，醇類、醛類及酮類是20 個羊肚菌樣品揮發(fā)性物質中最主要的3 類，占總含量的60%～80%。

經過峰的比較篩選，共得到20 個樣品的24 個共同峰（表2），這些物質包括：2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、乙醇、2,3-丁二酮、戊醛、2-甲基戊醛、甲苯、十一烷、己醛、2-甲基丙醇、二甲苯、3-甲基丁醇、桉油精、2-戊基呋喃、正戊醇、正己醇、薄荷酮、薄荷酮異構體、苯甲醛、莰酮、乙酸薄荷酯、胡薄荷酮、萘。這些物質占總峰面積相對含量平均為77.26%，包含了揮發(fā)物圖譜中主要的信息。從表2可知，20 個羊肚菌樣品中，醛類物質中2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛，酮類物質中薄荷酮及其異構體，醇類物質中3-甲基丁醇相對含量較高，且共有物質中不同樣品間各類物質差異較大，醛類物質相對含量為14%～72.42%，醇類物質相對含量為4.7%～23.41%，酮類物質相對含量為4.4%～30.87%，酯類物質相對含量為0.28%～2.55%，烴類物質相對含量為2.62%～13.42%，雜環(huán)類物質相對含量為2.86%～15.17%，不含酸類物質。在所有共有物質中，醛類物質相對含量最高，平均達32.19%，其次為酮類物質，平均達到17.33%，再次為醇類物質，平均含量達到11.55%，烴類和雜環(huán)類物質相對含量相對較低，分別為6.84%和7.94%，酯類物質相對含量最低，為1.40%。從整體上看，不同樣品的揮發(fā)性物質變化差異較大，含量變化無明顯規(guī)律性，而以揮發(fā)性物質相對含量的變化為依據對其進行品種篩選和分類不科學，因此，采用PCA和CA的方式對羊肚菌樣品進行綜合評價和品質區(qū)分，便于選擇品質類似羊肚菌樣品，為羊肚菌品種選育和后期生產加工應用提供參考條件。

表1 不同種類揮發(fā)性成分在羊肚菌中的相對含量Table 1 Percentage contents of different classes of volatile compounds in M. importuna%

表2 共有物質種類及相對含量Table 2 Relative amounts of volatile substances simultaneously detected in 20 samples of M. importuna%

續(xù)表2 %

2.2 羊肚菌揮發(fā)性物質的PCA

表3 PCA特征向量、特征值、方差貢獻率及累計方差貢獻率Table 3 Eigenvectors, eigenvalues, variance contribution rates and cumulative contribution rates of the principal components

通過SPSS 22.0軟件對20 個羊肚菌樣品共有揮發(fā)性物質的相對含量進行PCA，結果顯示前6 個主成分的累計方差貢獻率為90.081%（表3），表明前6 個主成分基本包含了羊肚菌揮發(fā)性物質的絕大部分信息，可用于綜合品質進行評價。前6 個主成分中，第1主成分的貢獻率為33.983%，貢獻最大為薄荷酮及其異構體，對應的特征值為0.330和0.331，胡薄荷酮、乙酸薄荷酯、莰酮、桉油精、2-甲基丁醛對第1主成分影響也較大。第2主成分的貢獻率為18.567%，貢獻最大為正戊醇，對應的特征值為0.393，代表變量有正己醇、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、2-甲基丙醛。第3主成分的貢獻率為14.136%，貢獻最大為十一烷，對應的特征值為0.389，代表變量有3-甲基丁醇、戊基呋喃、苯甲醛、莰酮、萘。第4主成分貢獻率為11.697%，貢獻最大為二甲苯，對應的特征值為0.408， 2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、萘對其影響較大。第5主成分貢獻率為6.299%，貢獻最大為乙醇，對應的特征值為0.664。第6主成分貢獻率5.398%，貢獻最大為甲苯，對應的特征值為0.585，丁二酮、甲基戊醛、十一烷、桉油精對其影響較大。

以不同特征值的方差貢獻率βi（i=1,2,3,……,K）為加權系數，利用綜合評價函數F=β1F1+β2F2+β3F3+……+βKFK計算各樣本得分，對羊肚菌樣本的香氣成分進行評價。根據特征值和相應的特征向量，用6 個主成分對不同樣品揮發(fā)性物質進行綜合評價，計算樣品的主成分得分，最終基于PCA得到香氣評價模型：

F=33.983%F1+18.567%F2+14.136%F3+11.697%F4+6.299%F5+5.398%F6

總因子F得分越高，表明品質越好。由表4可知，樣品4、20、8、14、12分別居主成分得分的前5 名，表明這5 個樣品綜合品質表現最好，隨后從高到低排序依次為11、2、10、6、5、13、1、7、3、19、18、15、9、17、16。

表4 不同羊肚菌樣品香氣質量評價Table 4 Aroma quality evaluation of different samples

2.3 羊肚菌揮發(fā)性物質的CA

采用系統(tǒng)聚類方法，度量標準為平方Euclidean距離，通過組間連接的方式，以共有揮發(fā)性物質作為變量，對20 個樣品的揮發(fā)性物質進行CA，結果見圖1。由圖1可知，當刻度為15～25時，22 個羊肚菌樣品可分為2 個集群，分別是樣品4為1 個集群，該樣品綜合得分為2.872，綜合主成分得分排名第1，品質最優(yōu)，其余19 個樣品為1 個集群，綜合得分在-1.550～1.481間，綜合品質低于樣品4；當刻度為10～14時，可分為3 個集群，后1 集群可再分為2 個集群，樣品9、17、3、7、19、15、16、1、6、11、18為1 個集群，樣品8、14、10、13、2、5、20、12為1 個集群；當刻度在5～10時，在以上分類基礎上，還可再細分，集成5 個集群，樣品9、17、3、7、19、15、16集成1 個集群，樣品1、6、11、18集成1 個集群，樣品8、14、10、13、2、5、20集成1 個集群，樣品12為1 個集群。CA根據刻度不同可獲得多種分類結果，而PCA根據主成分得分僅獲得一種分類結果，PCA同CA刻度為15～25時結果相一致，說明通過二者的分析，均可對20 個羊肚菌樣品進行分類，通過對菌株進行分類和綜合品質評價，可判斷同一集群內的菌株香味相似，為菌種選育提供理論依據，從而指導生產。

圖1 20 個羊肚菌樣品CA樹狀圖Fig. 1 Cluster analysis dendrogram of 20 samples

3 討 論

食用菌香味物質主要是食用菌在受熱過程中產生的多種揮發(fā)性風味物質綜合平衡的結果，成分差異較大，也比較復雜，主要有不飽和醛酮、醇類、含硫化合物以及一些萜烯類雜環(huán)化合物等[29-31]，但每種食用菌均有其獨特的揮發(fā)性物質。羊肚菌的香氣來源于豐富多樣的揮發(fā)性物質，是羊肚菌具有獨特香味的重要原因，也是衡量品質的重要指標之一。目前羊肚菌在馴化過程中常以感官和產量作為品種篩選標準，以外觀作為品質指標，以此指標進行商品分級，而忽略了羊肚菌揮發(fā)性風味物質對品質的重要影響，導致內在品質參差不齊。在羊肚菌馴化栽培過程中應“量”和“質”兼顧，在考慮產量的同時，揮發(fā)性物質也是重要的考察因素，是反映羊肚菌品質的重要指標來源。本實驗通過揮發(fā)性物質定性定量檢測，通過PCA進行綜合評價，建立香氣評價模型，進一步通過CA進行區(qū)分和驗證。這種綜合指標評價方法可以有效指導羊肚菌生產，提高羊肚菌的商品價值，避免了食用菌研究中常出現的重產量輕品質的現象，是未來食用菌品種選育、栽培工藝研究以及產品加工的重要發(fā)展方向。

大量研究表明，揮發(fā)性八碳化合物（C8H16O）是食用菌最重要的風味化合物，主要包括1-辛烯-3-醇、1-辛烯-4-醇、3-辛烯-2-醇等，這些物質具有濃烈的蘑菇風味，尤其是1-辛烯-3-醇，普遍存在于大部分食用菌中[31-34]，但在本研究的20 個羊肚菌樣品中均未檢出，這與1-辛烯-3-醇穩(wěn)定性低，各種干制方法，包括自然干燥、冷凍干燥、滾筒干燥、噴霧干燥和流化床干燥等都可能對它造成破壞有關[35-36]，但也不排除可能是羊肚菌中不含有1-辛烯-3-醇，它的獨特香氣與該物質無關，在后續(xù)研究有必要進一步擴大樣本量，驗證該結果。

4 結 論

本研究檢測分析了20 個羊肚菌樣品中的揮發(fā)性物質種類和含量，并采用統(tǒng)計學方法探討了羊肚菌特征香味物質，根據此研究結果和香氣模型可為不同品種的羊肚菌樣品提供判定依據，為羊肚菌在品種選育、品質區(qū)分及后期產品加工提供參考。

利用HS-SPME-GC-MS對不同來源、不同品種樣品的揮發(fā)性物質進行定性定量分析，結果表明醇、醛、酮類是羊肚菌揮發(fā)性物質最主要的3 類，占總量的60%～80%。

20 個樣品中包含了24 個共同物質：2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、乙醇、2,3-丁二酮、戊醛、2-甲基戊醛、甲苯、十一烷、己醛、2-甲基丙醇、二甲苯、3-甲基丁醇、桉油精、2-戊基呋喃、正戊醇、正己醇、薄荷酮、薄荷酮異構體、苯甲醛、莰酮、乙酸薄荷酯、胡薄荷酮、萘，這些成分含量的差別造成了不同羊肚菌樣本香氣的差異性。

基于PCA法構建了羊肚菌綜合香氣評價模型：F=33.983%F1+18.567%F2+14.136%F3+11.697%F4+6.299%F5+5.398%F6，得到不同樣品綜合品質得分從高到低為4、20、8、14、12、11、2、10、6、5、13、1、7、3、19、18、15、9、17、16。

通過CA，在刻度為15～25時，羊肚菌樣品可以分為2 個集群，樣品4 為1 個集群，其余樣品為1 個集群，結果與PCA一致，即綜合品質排第1的樣品4為1 類，綜合品質排2～20的樣品歸為1 類，由此可見CA法和PCA法能較好地反映羊肚菌樣品間的差異性。