七葉皂苷鈉對糖尿病模型大鼠血-視網膜屏障損傷的保護作用及機制研究

陳 珍 俞頌平 李 俊 蘭淑琴

糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）為50歲以上糖尿病患者的主要致盲原因，是糖尿病的重要并發癥之一。循環高血糖狀態造成機體微血管循環障礙，損傷血管內皮細胞，從而引發微血管瘤、出血、滲出、水腫、新生血管形成、黃斑囊樣水腫，以及玻璃體出血、視網膜前出血等一系列的眼底病變。病變早期主要以改善微循環治療為主，但藥物選擇有限，晚期以視網膜光凝術以及玻璃體切割手術為主，但手術后患者喪失部分視力、視野，給患者帶來永久傷害。

七葉皂苷鈉從七葉樹果實婆羅子中提取的有效成分，具有抗氧化、抑制炎癥反應[1-2]。研究表明，七葉皂苷鈉通過減少細胞消耗三磷酸腺苷，維持血管內皮功能，減輕黃嘌呤氧化酶活性而減少氧自由基對機體的作用，進而穩定血腦屏障，保護神經作用[3-4]。本研究制備糖尿病大鼠模型，觀察七葉皂苷鈉對糖尿病大鼠血-視網膜屏障的保護作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康的成年雄性（SD）大鼠（溫州醫科大學實驗動物中心提供[SCXK（浙）2010-0044]），約8～12周齡，體質量180～220g之間，在普通的環境下（恒溫18～23℃，通風，濕度60%）飼養，喂以普通飼料，自由飲水。

1.2 主要藥物與試劑 注射用七葉皂苷鈉（ESC）購自山東綠葉制藥有限公司，批號2006051329（D1）；鏈脲佐菌素（streptozotosin，STZ），批號CAS18883-66-4、伊文思藍（Evansblue，EB），批號 CAS314-13-6，購自美國sigma公司；甲酰胺、SDS購自上海生工生物工程有限公司；p-MLC單克隆抗體[3675s]購自Signaling公司；Occludin單克隆抗體、Rock單克隆抗體購自SANTA CRUZ公司；檸檬酸、檸檬酸三鈉、多聚甲醛、水合氯醛購自國藥試劑；ECL化學發光液購自Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模及分組 將禁食12h的大鼠按體質量（45mg/kg）一次性尾靜脈注射新鮮配制并預冷的鏈脲佐菌素檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.5），誘導糖尿病模型，注射完畢后觀察2h，開始飲食。連續3天。正常小鼠給予相同體積生理鹽水做為對照。3天后尿糖（+++）以上，空腹血糖16.00mmol/L以上，并出現多飲、多尿、多食等癥狀即認為造模成功，然后隨機分為糖尿病組和七葉皂苷鈉組，每組6只。ESC組大鼠每日定時 ESC 灌胃，劑量為 1.5mg·kg-1·d-1，連續 12周，每4周監測血糖和體質量，各組采集6只大鼠數據。每4周，水合氯醛麻醉大鼠，每組隨機取2只大鼠眼球（12只眼），用作后續實驗。

1.3.2 大鼠視網膜組織EB滲漏值檢測 腹腔注射水合氯醛（50mg/kg）麻醉大鼠，1min內尾靜脈注入EB溶液（45mg/kg），循環2h后，頸靜脈灌注生理鹽水（37℃）2min，即刻取出眼球，檢測EB滲漏值。

1.3.3 Western blot檢測視網膜組織occludin、ROCK和P-MLC蛋白表達量 摘取大鼠眼球，顯微鏡下分離出視網膜組織，TBS與蒸餾水反復沖洗，加入細胞裂解緩沖液，于冰上超聲勻漿，勻漿液于低溫（4℃）離心機（1-14型，美國sigma公司）離心30min，12000r/min，取上清液，蛋白定量，上樣，轉膜，封閉，加入一抗于室溫微搖2h，用PBS洗滌3次，轉入TBS溶液中，室溫微搖10min；與二抗室溫微搖1h，用TBS洗3次后，加入ECL化學發光液反應1-3min，置于凝膠成像系統拍照。

1.4 統計學方法 應用SPSS14.0統計軟件處理數據，計量資料以均數標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血糖及體質量比較 糖尿病組與正常對照組大鼠在各時間點血糖水平變化差異有統計學意義（P<0.01），模型組大鼠成模后，血糖水平穩定，ESC給藥對血糖未見影響。七葉皂苷鈉組大鼠體質量與正常組比較則稍有下降，但明顯比糖尿病組好，差異有統計學意義（P<0.01），ESC給藥對糖尿病大鼠體質量維持有正面影響。見表1-2。

表1 各組大鼠血糖水平比較（mmol/L，

表1 各組大鼠血糖水平比較（mmol/L，

注：與同期正常組比較，*P<0.01；DM組：糖尿病組；ESC組：七葉皂苷鈉組

組別正常組DM組ESC組鼠數666實驗0周4.61±0.68 4.52±0.78 4.51±0.97實驗4周4.60±0.87 27.16±5.74*28.51±5.61*實驗8周4.58±2.61 26.13±5.74*24.53±3.61*實驗12周4.61±1.34 26.30±6.43*24.84±4.03*

2.2 各組大鼠血-視網膜屏障對伊文思藍（EB）滲漏變化 與正常組比較，糖尿病組大鼠視網膜對EB的滲透量顯著增多（P<0.01）。七葉皂苷鈉組EB滲漏值較糖尿病組明顯降低（P<0.01），且于前4周差異最為明顯。見表3。

2.3 七葉皂苷鈉對DR大鼠視網膜組織occludin蛋白表達量的影響 七葉皂苷鈉組大鼠視網膜組織occludin蛋白表達量較糖尿病組大鼠視網膜組織occludin蛋白表達量明顯增加（P<0.01），ESC影響大鼠視網膜組織表達Occludin蛋白，在第8周及12周明顯。見表4、插頁圖1。

表2 各組大鼠體質量改變

表2 各組大鼠體質量改變

注：與同期正常組比較，*P<0.01，與同期DM組比較，△P<0.01；DM組：糖尿病組；ESC組：七葉皂苷鈉組

組別正常組DM組ESC組鼠數666實驗0周202.30±14.56 201.31±15.46 204.52±13.86實驗4周261.01±23.80 186.40±15.46*247.03±17.87*△實驗8周315.01±21.54 211.64±19.32*285.47±16.86*△實驗12周363.83±11.23 242.81±7.75*327.82±14.61*△

表3 各組大鼠視網膜組織對EB滲漏值比較（ng/mg，

表3 各組大鼠視網膜組織對EB滲漏值比較（ng/mg，

注：與同期正常組比較，*P<0.01，與同期DM組比較，△P<0.01；DM組：糖尿病組；ESC組：七葉皂苷鈉組

組別正常組DM組ESC組鼠數666實驗4周12.34±4.30 26.23±2.00*13.27±0.77△實驗8周12.67±2.11 29.78±1.78*18.01±1.77△實驗12周12.45±4.40 34.08±3.03*21.05±1.50*△

表4 各組大鼠視網膜組織occludin蛋白表達量比較

表4 各組大鼠視網膜組織occludin蛋白表達量比較

注：與同期正常組比較，*P<0.01，與同期DM組比較，△P<0.01；DM組：糖尿病組；ESC組：七葉皂苷鈉組

組別正常組DM組ESC組鼠數666實驗4周4.52±0.75 3.59±0.64*4.58±0.53△實驗8周4.67±0.81 2.26±0.45*3.65±0.71△實驗12周4.45±0.78 1.23±0.47*3.45±0.58△

2.4 七葉皂苷鈉對DR大鼠視網膜組織ROCK蛋白/P-MLC蛋白表達量的影響 七葉皂苷鈉組大鼠視網膜組織ROCK蛋白、P-MLC蛋白表達量較糖尿病組大鼠視網膜組織ROCK蛋白、P-MLC蛋白表達量明顯降低（P<0.01）。見表 5-6，插頁圖2-3。

表5 各組大鼠視網膜組織ROCK蛋白表達量比較

表5 各組大鼠視網膜組織ROCK蛋白表達量比較

注：與同期正常組比較，*P<0.01，與同期DM組比較，△P<0.01；DM組：糖尿病組；ESC組：七葉皂苷鈉組

組別正常組DM組ESC組鼠數666實驗4周0.74±0.36 1.45±0.53*1.05±0.49△實驗8周0.67±0.81 2.76±0.32*1.84±0.71△實驗12周0.81±0.78 3.82±0.49*2.34±0.51△

表6 各組大鼠視網膜組織P-MLC蛋白表達量比較

表6 各組大鼠視網膜組織P-MLC蛋白表達量比較

注：與同期正常組比較，*P<0.01，與同期DM組比較，△P<0.01；DM組：糖尿病組；ESC組：七葉皂苷鈉組

組別正常組DM組ESC組鼠數666實驗4周0.52±0.23 0.95±0.62*0.71±0.49△實驗8周0.61±0.41 1.96±0.59*1.01±0.61△實驗12周0.49±0.38 2.67±0.65*1.54±0.51△

3 討 論

DR早期的標志性病變為BRB的破壞與血管滲透性增加，BRB在調節血管通透性、神經視網膜組織營養物質和氧氣的傳輸中起重要作用[5-7]。高血糖狀態下，機體通過激活蛋白激酶C、多元醇、非酶糖基化終產物等通路開啟糖尿病性代謝，致使體內氧化與抗氧化系統失平衡，過氧化物產生增加，氧化物清除減少，氧化應激產生，造成機體損傷，視網膜中的多不飽和脂肪酸含量高，對氧及葡萄糖的需求大，高血糖對于視網膜的損傷尤為明顯，破壞BRB及提高血管通透性。本研究結果顯示，七葉皂苷鈉能夠減少DR大鼠視網膜組織的伊文思藍滲漏，能夠增加DR大鼠視網膜組織occludin蛋白的表達以及抑制DR大鼠視網膜組織ROCK蛋白/P-MLC蛋白表達，說明七葉皂苷鈉具有保護DR大鼠BRB的功效。七葉皂苷鈉通過抑制炎性介質釋放作用，改善微循環，穩定血管內皮功能，降低毛細血管通透性[8-9]，在本實驗中表現為降低視網膜組織的伊文思藍的滲漏。

Occludin是一種跨膜蛋白，其作用是保持上皮細胞及內皮細胞間結構的完整性，同時形成一種高度極化性的屏障來維持動物體內微環境的穩定[10]。Occludin蛋白受多種機制調控，其中血管內皮生長因子（VEGF）、粘附分子等炎癥介質會導致其表達下降，從而影響細胞間的滲透性[11]。有報道顯示，Occludin蛋白在DR視網膜組織中表達降低[12-13]。七葉皂苷鈉通過降低VEGF表達[14]，增加組織occludin蛋白表達量，與本實驗結果相符；禹海[15]等研究發現，糖尿病大鼠視網膜中粘附分子與occuldin蛋白表達呈顯著負相關，抑制粘附分子可增加occuldin蛋白表達。根據實驗結果顯示，七葉皂苷鈉通過增加DR大鼠視網膜組織occludin蛋白表達保護DR大鼠BRB。

Rho/ROCK細胞信號通路與血管通透性的調節有密切關聯[16]，陳曦等[17]研究發現，高血糖環境誘導Rho/ROCK活化，活化的ROCK上調TNF-α、ICAM-1表達，增加白細胞粘附，引發一系列炎癥反應。在本實驗發現，當發生糖尿病視網膜疾病時以及在糖尿病視網膜疾病的發生發過程中，ROCK通路一直處于激活狀態，而其底物MLC的磷酸化水平也不斷地升高，與Arita等[18]研究相符。根據實驗結果，七葉皂苷鈉能夠抑制視網膜組織ROCK蛋白及P-MLC蛋白表達量，考慮七葉皂苷鈉通過抑制ROCK/P-MLC通路激活而達到抑制炎癥反應的作用，從而保護BRB功能；但其具體作用靶點不得而知，需進一步實驗研究，這也是本實驗的不足之處。

綜上所述，七葉皂苷鈉可能通過提升occludin蛋白表達量，抑制ROCK細胞信號轉導通路，降低視網膜血管內皮細胞的通透性，穩定BRB功能，阻止糖尿病視網膜病變的發生發展，其具有改善大鼠DR的藥效活性。