HPLC-波長切換法同時測定牛黃清胃丸中7個成分的含量Δ

吳志芳，聶黎行（1.大同市第三人民醫院藥學部，山西大同037008；2.中國食品藥品檢定研究院，北京100050）

牛黃清胃丸由人工牛黃、大黃、菊花、麥冬、薄荷、石膏、梔子、玄參、番瀉葉、黃芩、甘草、桔梗、黃柏、連翹、牽牛子、枳實、冰片等17味藥材制成，具有清胃瀉火、潤燥通便的功效，主要用于心胃火盛、頭暈目眩、口舌生瘡、牙齦腫痛、乳蛾咽痛、便秘尿赤的治療[1]。原國家食品藥品監督管理總局批準的牛黃清胃丸批準文號有103個，其中大蜜丸97個、水蜜丸4個、小蜜丸和蜜丸各1個。牛黃清胃丸生產廠家多，臨床使用量較大，但其標準中僅采用顯微法對部分組方藥材進行鑒別，缺乏有效的質量控制手段。

目前，分別測定牛黃清胃丸中黃芩苷、梔子苷、綠原酸、大黃素和大黃酚含量的高效液相色譜法（HPLC）已有文獻報道[2-5]，但因其組方藥味眾多，只對其中的黃芩、梔子、菊花、大黃等個別藥材中的指標成分進行了含量測定，難以有效評價中成藥的質量。現代藥理研究表明，菊花中主要成分綠原酸具有抗菌、抗病毒及保護心血管等藥理作用[6]；梔子中主要成分梔子苷具有保肝和保護心血管系統作用[7]；連翹中主要成分連翹酯苷A具有抗菌、抗病毒及松弛血管等作用[8]；枳殼中主要成分柚皮苷具有抗病原微生物和保護心腦血管等作用[9]；黃芩中主要成分黃芩苷具有保肝、抗病毒、保護心血管等作用[10]；甘草中主要成分甘草酸具有保肝、抗病毒及免疫調節等作用[11]；大黃中主要成分大黃酚具有保護心血管系統作用[12]。以上這些化學成分是牛黃清胃丸多種治療作用中的主要有效成分，是牛黃清胃丸中的主要質量控制指標。為提升牛黃清胃丸的質量標準，有效控制其制劑質量，本試驗建立了HPLC-波長切換法同時測定牛黃清胃丸中綠原酸、梔子苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸銨、大黃酚7個成分含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200型HPLC儀，包括四元泵、可變波長檢測器（VWD）、自動進樣器、ChemStation型化學工作站（美國安捷倫科技有限公司）；MettlerAE240型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ3200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

綠原酸（批號：110753-201716，純度：99.3%）、梔子苷（批號：110749-201718，純度：97.6%）、連翹酯苷A（批號：111810-201707，純度：97.2%）、柚皮苷（批號：110722-201613，純度：94.3%）、黃芩苷（批號：110715-201720，純度：93.5%）、甘草酸銨（批號：110731-201720，純度：97.7%）、大黃酚（批號：110796-201621，純度：99.2%）對照品均來源于中國食品藥品檢定研究院；牛黃清胃丸（大蜜丸，藥都制藥集團股份有限公司，批號：170801、170301、171101，規格：每丸質量6 g）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，10%～15%A；20～30 min，15%～20%A；30～40 min，20%～25%A；40～35 min，25%～40%A；45～62 min，40%～65%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：0～8 min，348 nm（綠原酸）；8～15 min，238 nm（梔子苷）；15～29 min，330 nm（連翹酯苷A）；29～39 min，280 nm（柚皮苷和黃芩苷）；39～58 min，237 nm（甘草酸銨）；58～62 min，254 nm（大黃酚）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。理論板數按綠原酸峰計應不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、梔子苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸銨、大黃酚對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含綠原酸233.4 μg、梔子苷858.1 μg、連翹酯苷A833.4 μg、柚皮苷786.6 μg、黃芩苷1196 μg、甘草酸銨203.8 μg、大黃酚206.7 μg的對照品貯備液；再分別精密量取綠原酸對照品貯備液0.5 mL、梔子苷對照品貯備液0.5 mL、連翹酯苷A對照品貯備液1.5 mL、柚皮苷對照品貯備液1.5 mL、黃芩苷對照品貯備液1.0 mL、甘草酸銨對照品貯備液1.5 mL、大黃酚對照品貯備液0.3 mL，置于同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取牛黃清胃丸，剪碎。取約1.0 g，精密稱定，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方比例和制備工藝分別制備缺菊花（綠原酸）、梔子（梔子苷）、連翹（連翹酯苷A）、枳實（柚皮苷）、黃芩（黃芩苷）、甘草（甘草酸銨）、大黃（大黃酚）的陰性樣品，按“2.2.2”項下制備方法制成7種陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取混合對照品溶液、供試品溶液（批號：170801）與7種陰性對照溶液進樣，按“2.1”項下色譜條件分析。結果，色譜圖中其他成分對綠原酸、梔子苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸銨、大黃酚的測定未見干擾，各待測成分色譜峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，且峰形較佳。9種溶液的色譜圖見圖1。

2.4 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜峰的峰面積。以對照品的進樣量（μg）為橫坐標、相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，各成分的回歸方程、線性范圍以及相關系數見表1。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積，計算得到綠原酸、梔子苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸銨和大黃酚峰面積的RSD分別為0.98%、1.04%、0.59%、1.50%、0.83%、1.24%和1.32%（n＝6），結果表明儀器精密度良好。

2.6 定量限試驗

分別取綠原酸、梔子苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸銨和大黃酚對照品貯備液，加甲醇逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣，記錄色譜圖。以信噪比為10∶1時的對照品溶液質量濃度，確定綠原酸、梔子苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸銨和大黃酚的定量限分別為1.167、0.858 、1.250 、1.180 、1.196、0.611、0.620 μg/mL。

2.7 穩定性試驗

取供試品溶液（批號：170801），在“2.1”項色譜條件下，分別在放置0、1、2、4、8、12 h后進樣，測定綠原酸、梔子苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸銨和大黃酚峰面積，計算得到峰面積的RSD分別為1.21%、0.97%、1.42%、0.71%、0.98%、1.87%和1.63%（n＝6），結果表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.8 重復性試驗

取同一批號樣品（批號：170801），按照“2.2.2”供試品溶液制備方法制備6份溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，計算得到綠原酸、梔子苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸銨和大黃酚含量的平均值分別為0.267、1.278 、3.391、3.015、3.171、0.911、0.142 mg/g，RSD分別為1.47%、1.93%、1.95%、2.30%、1.78%、1.61%和2.18%（n＝6），結果表明此方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：170801）6份，每份約0.5 g，置于25 mL量瓶中，分別加入各對照品溶液適量，依據“2.2.2”供試品溶液的制備方法平行制備6份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

表2 回收率試驗結果Tab 2 Results of recovery tests

2.10 樣品含量測定

取3批牛黃清胃丸（批號：170801、170301、171101），分別按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣測定。計算3批樣品中綠原酸、梔子苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸銨和大黃酚的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果Tab 3 Results of content determination of samples

3 討論

牛黃清胃丸為相應組方藥材粉碎過篩混勻后加入煉蜜制成的大蜜丸。采用粉末直接入藥的方式，可以最大程度地保留藥材中的有效成分，避免提取加工過程對藥品質量的影響，但同時會產生重金屬及有害化學元素整體殘留的風險。本課題組前期采用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）對其中鉛、鎘、砷、汞、銅的殘留量進行測定，對此中成藥質量進行風險評估，結果令人滿意[13-14]，繼而再在此基礎上對其有效成分的含量進行控制。

綠原酸、梔子苷、連翹酯苷A、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸銨和大黃酚分別為牛黃清胃丸中組方藥材菊花、梔子、連翹、枳實、黃芩、甘草和大黃的主要成分，具有抗菌、抗病毒、保肝及保護心血管等多種藥理作用，是發揮其治療作用的主要有效成分。本研究采用HPLC-波長切換法同時進行多個成分的含量測定，不需要提高檢測器的配置，且該法已經越來越多地用于控制中成藥復方制劑的質量[15-16]。采用波長切換法對牛黃清胃丸組方藥材菊花、梔子、連翹、枳實、黃芩、甘草、大黃中的7個指標成分進行含量測定，可以簡便快速評價該中成藥的質量，為后續收集的樣品開展含量測定研究奠定了方法基礎。另外，本課題組還將采用氣相色譜法對組方藥材冰片中龍腦和異龍腦的總量進行測定，以進一步完善牛黃清胃丸的質量評價方法，全面提升該中成藥的質量標準。