基于末端脫氧核糖核酸轉移酶的納米界面上DNA的生長策略及用于恩諾沙星的適配體傳感器構建研究

杜玉梅，周洋洋，卞曉軍，2，3，顏 娟，2，3*

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海 201306)

納米生物技術如今在多種領域發揮著重要作用[1-3]。1996年Mirkin等[4]首次提出通過金硫共價鍵在納米金顆粒表面組裝巰基DNA。納米金(Au nanoparticles,AuNPs)具有功能性的表面、良好的生物相容性、較低的毒性等特殊性質，可以和寡核苷酸鏈、蛋白質等組裝[5]。與生物材料相結合后的納米金化學性質更加穩定，較大的表面積形成的自組裝平臺可提供更多的結合位點。基于納米金的多重優越性，以金屬納米顆粒為載體構建的各種功能性納米生物探針或者傳感器已被廣泛應用于生物成像以及分子檢測[6-7]。

適配體[8](Aptamer)是一段通過指數富集的配體系統進化技術(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)篩選而來的寡核苷酸序列，能夠高特異性和高選擇性的識別細胞、核酸、蛋白質和小分子等靶分子[9-10]。相比于抗體，適配體易于合成和修飾、熱穩定性好、成本較低、無毒性。因此，基于適配體的生物傳感器已被廣泛應用于各種分析檢測[11-12]。單純的依賴適配體捕獲靶標前后構象變化[13]產生的信號，在檢測方面的應用十分有限。為了進一步提升適配體生物傳感器應用的廣泛性，常常需要結合信號放大策略。尤其是基于核酸擴增的信號放大策略[14]，包括聚合酶鏈式反應[15](Polymerase chain reaction,PCR)以及滾環擴增技術[16-17](Rolling circle amplification,RCA)和環介導等溫核酸擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等。然而PCR技術不僅需要嚴格的溫度控制，也需要擴增模板。等溫核酸擴增中[18-19]，RCA不僅需要環狀模板，還需要特殊的引物設計；LAMP[20]雖不需要模板，但其需要多條引物以及設計復雜等弊端對該技術的廣泛使用造成了一定的限制。末端脫氧核糖核酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase,TdTase)[21-24]是一種在寡核苷酸鏈的3′-OH 端重復添加單核苷酸的酶，該操作無需模板和溫度控制，常溫下就能實現DNA鏈的末端延伸。

恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)別稱乙基環丙沙星，是一種人工合成的氟喹諾酮類抗菌藥物[25]，現已被廣泛應用于各種動物感染性疾病的預防和治療，尤其近年來，在水生動物疾病防治中的應用發展迅猛。然而ENR的大量使用，造成了其在動物源食品中的過多殘留，這種殘留通過食物鏈的傳遞對人體造成毒副作用[26]。本研究使用ENR的核酸適配體組裝在納米金表面作為識別納米生物探針，結合磁珠(Microbeads,MBs)分離技術構建針對ENR的適配體傳感器(Aptasensor)，通過TdTase介導的常溫下納米界面DNA的生長，實現了ENR識別信號的放大，從而建立了一種簡單易操作的用于食品中ENR殘留的檢測分析方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

末端脫氧核糖核酸轉移酶(20 U/μL，上海碧云天生物技術有限公司)；磷酸鹽緩沖液(20×PBS,pH 7.4～7.6)、瓊脂糖IV(TM)、電泳緩沖液(50×TAE,pH 8.4)、4S Red Plus 核酸染色劑(10 000×水溶液)、脫氧核苷酸(dNTP,10 mmol/L)、三磷酸脫氧腺苷(dATP,100 mmol/L)、酪蛋白(Casein)、恩諾沙星(ENR)、諾氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)及環丙沙星鹽酸鹽(Ciprofloxacin hydrochloride)均購于生工生物工程(上海)股份有限公司；生物素標記的混合堿基(含有Biotin-dUTP,1 mmol/L，賽默科技有限公司)；3，3’，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB，美國Neogen公司)；親和素標記的辣根過氧化物酶(avidin-HRP，eBioscience)；8600-10氨基磁珠(美國Polysciences,Inc.)；牛血清白蛋白(BSA，美國Amresco公司)；氯金酸(美國Strem Chemical 公司)；實驗用水均為Milli-Q水(電阻率18.2 MΩ·cm,Millipore純化系統，美國密理博公司)；涉及的DNA序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并純化，純度為HPLC級，其中DNA1(Aptamer1)為 5'SH-AAAAAAAAAA-CCCATCAGGGGGCTAGGCTAACACGGTTCGGC-OH-3；DNA2(Aptamer2)為5’-TCTCTGAGCCCGGGTTATTTCAGGGGGA -NH2-3’。

恒溫振蕩金屬浴(HCM100-Pro，大龍興創實驗儀器(北京)有限公司)；Synergy2 SLFPTAD 多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；UV-2450紫外可見光光度計(日本島津公司)；凝膠成像分析系統(美國伯樂BIO-RAD Gel Doc XR)；840-030-602-R原子力顯微鏡(布魯克(北京)科技有限公司)；miniG手掌型離心機；Lab dancer 振蕩器；移液器(Thermomixer comfort Eppendorf,德國)；EOS 50D數字照相機(日本佳能)。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米金的制備參考經典的Frens方法[27]，在圓底燒瓶中倒入49 mL水，加入1 mL 1%氯金酸,加熱回流直至沸騰。待溶液沸騰后加入3.5 mL 1%的現配的檸檬酸三鈉，反應20 min后停止加熱。制備完成后將膠體金置于4 ℃備用。

1.2.2 納米生物探針Au-DNA1的制備在1 mL 15 nm膠體金(2.3 nmol/L)中加入20 μL 100 μmol/L 的SH-DNA1充分混合，室溫下輕微振蕩過夜孵育[28]。次日加入0.1 mol/L的PB溶液室溫下輕輕振蕩30 min使得終濃度為0.01mol/L，分次加入2 mol/L氯化鈉使得終濃度為0.15 mol/L進行老化，室溫下過夜。之后用0.01 mol/L PB溶液進行離心洗滌(4 ℃，12 000 r/min，20 min)3次，沉淀重懸在200 μL 1×PBS(含137 mmol/L氯化鈉、2.7 mmol/L氯化鉀、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液、2 mmol/L磷酸鉀)中4 ℃保存待用。

1.2.3 納米生物界面DNA的生長建立20 μL的反應體系，分別含有10 μL Au-DNA1，4 μL反應緩沖液，1 μL末端轉移酶，2 μL 1 mmol/L dNTPs(Biotin-dUTP∶dATP=1∶3)[25]，以及3 μL水。將該混合物充分混勻，37 ℃水浴中孵育1 h后用1×PBS緩沖液洗滌3次，最終重懸在20 μL 1×PBS溶液中備用。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳的表征配制1%瓊脂糖凝膠，取擴增前后的樣品8 μL加入預染色(含0.01%4S Red Plus 核酸染色)的凝膠中，室溫下在1×TAE中以90 V恒定電壓運行30 min，并在凝膠成像系統中拍照記錄。

1.2.5 原子力顯微鏡的表征取5 μL稀釋的樣品滴加至新鮮剝離的云母片，靜置5 min，緩慢滴加水數滴，用干凈的洗耳球或者氮氣吹干待測。大氣環境下在智能成像模式中使用SNL系列的掃描探針對樣品進行掃描。

1.2.6 MBs的活化磁珠活化過程參照產品說明推薦方法進行：取2 mL 50 mg/mL氨基磁珠溶液加入16 mL PWB緩沖液(Pyridine wash buffer,PWB)洗滌后渦旋振蕩充分混合。將離心管放在磁力架上靜置1 min，待上清液澄清后棄掉，重復洗滌3次。之后用PWB稀釋戊二醛，向磁珠中加入8 mL 5%戊二醛并渦旋混合，室溫下振蕩3 h，期間不斷地渦旋振蕩，以防磁珠下沉。磁分離下多次洗滌直至上清液澄清，之后PWB重復洗滌4次，最終磁珠重懸在10 mL的1×PBS中備用。

1.2.7 MBs-DNA2的制備取40 μL醛基化磁珠，磁響應后棄上清，加入8 μL 100 μmol/L的NH2-DNA2和80 μL 1×PBS充分混勻，37 ℃反應過夜孵育。次日，磁分離后加入100 μL 1×PBS洗滌1次。之后100 μL磁珠中加入100 μL 2%BSA室溫封閉1 h，磁分離后沉淀重懸在200 μL 1×PBS溶液中備用。

1.2.8 MBs-ENR-AuNPs三明治夾心適配體傳感器的構建建立50 μL的反應體系，其分別為10 μL MBs-DNA2，30 μL ENR(空白組是緩沖液)以及10 μL Au-DNA1，充分混勻后在振蕩金屬浴37 ℃反應1 h。反應結束后，磁分離下收集上清液對比顏色，沉淀物中加入50 μL 1×PBS溶液洗滌1次后備用。

1.2.9 比色測定基于TdTase的MBs-ENR-AuNPs三明治夾心結構表面的DNA生長后，加入50 μL 2%BSA和50 μL 0.25%Casein溶液聯合封閉30 min。之后磁分離去上清液，加入稀釋1 000倍的avidin-HRP溶液，室溫孵育30 min。反應結束后加入100 μL 1×PBS(0.2%Tween-20)充分洗滌6次，棄上清液后加入50 μL TMB(含H2O2)避光反應5～10 min。磁響應后，收集上清顯色溶液于96孔板中使用酶標儀(波長600 nm)測定吸收值。

2 結果與討論

2.1 實驗原理

納米界面DNA生長過程如圖1所示：以15 nm的納米金作為載體，5'端修飾巰基的DNA1鏈通過金硫共價鍵組裝在納米金的表面，剩余活性位點用BSA進行封閉。加入Biotin-dUTP和dAPT的混合溶液[25]，在TdTase的催化作用下，DNA1鏈的3′-OH末端進行延伸生長，得到一段嵌入生物素位點的ssDNA產物。

圖1 基于TdTase的納米界面上的DNA生長示意圖

2.2 AuNPs-DNA1與MBs-DNA2的紫外可見光譜

為考察納米金和磁珠表面組裝DNA后表面結構發生的變化，實驗對AuNPs以及AuNPs-DNA1進行紫外可見吸收光譜的掃描。結果顯示，裸金在519 nm處有明顯吸收峰，當納米金和SH-DNA1通過金硫鍵共價結合后，其最大紫外吸收峰發生紅移，在約522 nm處出現明顯的吸收峰(圖2A)，表明納米金和DNA序列成功組裝。同時，收集磁珠和DNA2組裝后的上清液(即溶液中未與磁珠組裝的游離NH2-DNA2)，測試其在波長260 nm處的吸收峰值為0.53；對比加入的總DNA2量(吸收值為0.70),紫外吸收值降低，即DNA2濃度降低(如圖2B)。DNA2吸收值的變化說明醛基化的磁珠和NH2-DNA2孵育后，一部分的DNA2成功組裝在磁珠表面，從而使得體系中游離NH2-DNA2的數量減少。

2.3 納米界面DNA生長產物的表征

采用瓊脂糖凝膠電泳成像和AFM成像技術表征了DNA在納米界面的生長情況。圖3A和B分別為瓊脂糖凝膠在紫外光和白光下的成像結果。其中M為DNA marker，泳道1的上樣樣品為AuNPs-DNA1；泳道2的樣品為AuNPs-DNA1中加入dATP，以及TdTase進行生長后的產物；泳道3的樣品為AuNPs-DNA1中加入dNTPs，以及TdTase進行生長后的產物；泳道4為MBs-DNA2；泳道5的樣品為MBs-DNA2中加入dATP，以及TdTase進行生長后的產物；泳道6的樣品為MBs-DNA2中加入dNTPs，以及TdTase進行生長后的產物。對比圖3A、B兩圖中的1～3三條泳道成像發現，2、3樣品位置比樣品1更接近進樣孔，由于擴增產物分子量變大后發生滯后，說明在TdTase的作用下納米金表面DNA成功延伸生長。然而在白光下雖能發現泳道2中納米金的條帶(圖3B)，在紫外成像中的相應位置卻無DNA條帶(圖3A，泳道2)，這是因為該樣品使用dATP進行DNA生長得到的產物為堿基A組成的長單鏈DNA(poly A)，該鏈由同種堿基組成，不易形成DNA二級結構，從而DNA染色劑(GelRed)不能有效嵌入，致使不能得到明顯的DNA條帶。

實驗繼續觀察了泳道4～6的成像結果。結果發現，無論生長時添加dATP，還是dNTPs，泳道中均未發現明顯的DNA條帶。這是因為MBs-DNA2探針表面無供TdTase作用的3′-OH端的位點，無法進行DNA的延伸生長。此結果不但表明了本研究的可行性，同時也避免了檢測體系中由于MBs表面可能的DNA延伸生長所帶來的背景信號。進一步采用AFM成像技術提供了更為直觀的表征結果。圖4A為 AuNPs-DNA1的AFM成像結果，可觀察到納米金顆粒的粒徑較為均一、分散性良好；然而其表面組裝的單鏈DNA1由于鏈長較短，無法形成明顯成像。經過TdTase介導的DNA生長過程之后，納米金顆粒周圍延伸出來多條ssDNA(圖4B)。經過測量，在單鏈本身的卷曲狀態下，產物ssDNA的長度已達850 nm，顯示TdTase在室溫下即已具備高效擴增性能。

2.4 基于TdTase的適配體傳感器用于恩諾沙星的檢測

2.4.1 檢測原理將TdTase-aptasensor應用于恩諾沙星標準樣的檢測，其檢測過程如圖5所示。MBs-ENR-AuNPs三明治復合結構表面經過TdTase介導的DNA生長過程之后，avidin-HRP可與擴增產物ssDNA鏈中嵌入的生物素位點高特異性識別。最后，加入底物TMB，HRP催化H2O2介導的TMB發生氧化反應，產生肉眼可見的從無色到藍色的顏色變化。

2.4.2 MBs-ENR-AuNPs三明治復合結構的驗證將恩諾沙星溶液(1 mg/mL)稀釋成0.25、0.1、0.05、0.025、0.01 mg/mL系列質量濃度溶液，并將制備的AuNPs-DNA1與MBs-DNA2兩種探針混合溶液依次加入上述系列溶液中，混勻并振蕩孵育后，利用磁分離技術收集上清液。結果顯示，隨著ENR濃度的遞減，上清液的顏色逐步加深。這表明當ENR濃度減少時，無足夠的ENR用于形成MBs-ENR-AuNPs三明治復合結構，在磁分離后，上清液中滯留更多的AuNPs-DNA1探針，溶液呈現的紅色加深。此結果也表明所使用的DNA1與DNA2兩條適配體片段對ENR分子具有良好的識別性能。

圖5 基于TdTase的適配體傳感器用于恩諾沙星檢測的示意圖Fig.5 Schematic diagram of TdTase-aptasensor for ENR detection

2.4.3 納米界面的DNA生長策略用于ENR適配體傳感器的可行性驗證將同等體積的0.1 mg/mL ENR(實驗組)與1×PBS(背景組)分別加入基于TdTase的適配體傳感檢測體系中，按照實驗方法中所述的靶標識別、界面生長、比色測定等一系列步驟后，肉眼觀察并用酶標儀測定兩組吸收值結果。結果如圖6A所示，實驗組催化TMB后上清顏色明顯深于背景組(插入圖)；且測定的實驗組的吸收值為0.51，背景組吸收值為0.019。數據表明基于TdTase的納米界面DNA生長策略能很好地適用于ENR的適配體傳感器的體系構建，通過DNA的生長、生物素位點的嵌入、酶催化信號的測定，可實現對體系中ENR的檢測；并且該體系背景信號較低，實驗組信號明顯優于背景組。

DNA生長后產物ssDNA的鏈長決定了產物鏈中嵌入的生物素位點的數目，從而影響到體系的檢測性能。因此，該實驗中通過采用瓊脂糖凝膠電泳，考察了不同生長時間所得產物ssDNA的分子量，以優化實驗中DNA的生長時間。結果如圖6B所示，泳道1上樣樣品為AuNPs-DNA1，泳道2～4樣品分別是生長時間為30 min、1 h、12 h的擴增產物。通過比較可以看出，與泳道1的AuNPs-DNA1相比，泳道2～4的分子量明顯增大，說明DNA成功延伸生長；進一步對比2～4三條泳道中產物的位置，發現泳道3，4的產物條帶比產物2更為彌散，說明生成了更多較大分子量的產物，然而產物3和4無明顯差別。這可能是由于實驗使用了較高活性的TdTase(20 U/μL)，其在較短時間內即可實現DNA的高效延伸。因此選定1 h作為DNA的最優生長時間，并用于后續ENR的檢測。

圖7 適配體傳感器對0.1 mg/mL ENR的特異性檢測Fig.7 Specificity of the aptamer sensors for 0.1 mg/mL ENR the other antibiotic concentrations：0.5 mg/mL

2.4.4 基于TdTase的適配體傳感器對ENR的響應性能分析在上述優化實驗條件下，本研究測試了基于TdTase的適配體傳感器對不同濃度ENR的響應能力以及特異性。在適配體傳感器中，加入不同濃度ENR溶液。發現隨著ENR濃度的增大，比色測定所得的吸收值越高。這是因為溶液中ENR分子越多，所形成的MBs-ENR-AuNPs三明治夾心復合結構數量越多，納米界面TdTase介導的DNA生長得到的ssDNA和生物素位點就越多，進而和生物素結合的avidin-HRP就越多，而更多的HRP催化TMB變色后得到的信號值越高，且波長600 nm處的吸收值與10～1.0×105ng/mL范圍內的ENR質量濃度呈良好的響應關系；當ENR溶液質量濃度低至1.0 ng/mL時，發現其檢測信號與空白組信號相比，仍有較好的區分。表明該適配體傳感器不但對不同濃度的ENR具有很好的響應能力，同時也具備檢測較低濃度靶分子的良好能力。

另外，實驗也測試了該傳感器的檢測特異性，即在適配體傳感器中加入0.1 mg/mL ENR和加入0.5 mg/mL喹諾酮類其他抗生素(環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星)及緩沖液進行對比。如圖7所示，溶液中的ENR信號值顯著高于其它對照組(環丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星)，表明本研究所構建的傳感器對ENR具備較好的檢測特異性。

3 結 論

本文構建了一種基于TdTase催化的納米界面上DNA生長策略的適配體比色傳感器。該方法在操作上無需貴重儀器，無需復雜的樣品前處理和嚴格的變溫操作。在初步應用于恩諾沙星標準樣的檢測過程中，發現基于Aptamer的MBs-ENR-AuNPs三明治夾心復合結構使得該傳感器具備良好檢測特異性；此外，由于DNA在納米界面的高效生長，體系中引入更多的HRP分子，使得該傳感器對不同濃度的ENR具備良好的響應性能。這為課題組后續將其應用于實際樣品中藥物殘留的檢測奠定了良好基礎。本研究發展的基于TdTase的適配體傳感器在食品安全檢測、臨床診斷、環境監測等方面均具備良好的應用前景。