高CO2濃度下外源糖對‘黑比諾’葡萄試管苗生長及光合特性的影響

金曉雲，趙鑫，蘇艷麗，劉伊騏，馮致*，毛娟*（甘肅農業大學園藝學院，甘肅蘭州 730070）

葡萄為多年生藤本漿果類果，有著悠久的種植歷史。‘黑比諾’作為重要的酒用品種，其果實產量和品質直接影響到葡萄酒的產量和品質。而植物組織培養技術作為一種方便快捷的培養技術，現已應用于藥用植物[1]、花卉[2]、果樹[3]、草業[4]和農業生產[5]等多個領域中并日趨發展成熟。在試管苗組織培養當中，外源糖可以作為碳源來維持植株正常生長發育，CO2的濃度也會影響到試管苗的生長發育。故研究外源糖以及高CO2濃度對葡萄試管苗的影響對進一步研究試管苗糖代謝以及CO2對試管苗生長的影響有著重要的意義。

外界條件能夠影響葡萄試管苗的生長。研究發現，外源糖種類的不同會影響試管苗相關酶活性的表達，糖代謝相關酶活性在試管苗生長發育過程中表現出差異顯著性，并且ZT、IAA、ABA含量在不同糖處理間均表現出一定的差異顯著性[6-9]，糖信號的轉導也參與了植物根離子轉運系統的調控[10]。糖還會誘導激素的產生，影響激素的生物合成[11]。糖也在植物生長發育、代謝調控及抵抗脅迫等方面具有重要調節作用，糖作為信號分子參與調控低溫脅迫[12]。而CO2濃度的升高可以增加紅樺可溶性蛋白的總量，改變可溶性蛋白的分配模式[13]。高濃度CO2條件下的香蕉葉片光合速率明顯高于低濃度CO2條件下的葉片光合速率[14]。另外，CO2濃度的升高有可能影響到了光合作用以及氮同化相關基因的轉錄[15]。培養基糖種類及CO2濃度的變化與植株的生長發育、激素調節、離子轉運、可溶性蛋白含量等相關。

外源糖與CO2濃度在植物生長各環節中發揮著重要作用，但高CO2濃度下不同糖種類對葡萄試管苗如何影響試管苗的生長發育、葉綠素熒光參數、可溶性蛋白質含量方面影響的相關研究鮮見報道。因此，本文以‘黑比諾’葡萄試管苗為材料，研究相關數據，進而分析高CO2濃度下外源糖種類的不同對葡萄試管苗生長發育及光合能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

試驗所用材料‘黑比諾’（Pinot Noir）試管苗來自甘肅農業大學園藝學院試驗室。以GS為基本培養基，分別加入蔗糖、葡萄糖、果糖各20 g/L作為3個糖源處理；正常CO2環境濃度（380±40）μmol/mol，3個糖源處理分別命名為S、G、F；高CO2環境（1000 μmol/mol）3個糖源處理分別命名為S1、G1、F1。轉接‘黑比諾’試管苗單芽莖段，轉接后放入PQX-430D人工氣候箱27 ℃、16 h光照/8 h黑暗進行培養，光照強度120 μmol/(m2·s)。高CO2處理PQX-430D人工氣候箱加裝CO2控制模塊。每7 d觀察一次，待生根后每3 d觀察一次。轉接第25天后測定試管苗葉片葉綠素熒光參數、可溶性蛋白含量以及葉綠素相對含量。

1.2 測定方法

可溶性蛋白質測定：采用考馬斯亮藍G-250染色法測定‘黑比諾’樣品中可溶性蛋白含量。

葉綠素相對含量測定：葉綠素含量采用SPAD-502葉綠素儀測定。利用SPAD-502葉綠素儀測定葉片的前中后3個不同的位置，計算其平均值，進行3次重復。

葉綠素熒光：將‘黑比諾’幼苗暗適應30 min，對充分展開的第3、4片功能葉利用調制葉綠素熒光成像系統（MAXI Imaging-PAM, Walz, Effeltrich, Germany）進行葉綠素熒光參數測定。1.3 數據處理

采用Excel 2010軟件進行試驗數據錄入以及數據圖表的制作。采用SPSS進行數據整理與統計分析。

2 結果與分析

2.1 高CO2濃度下不同糖種類對試管苗愈傷組織的影響

如圖1，正常條件G處理在轉接9 d后大量出現愈傷組織，18 d后出愈率達98%。轉接9 d后S處理試管苗70%出現愈傷組織，轉接21 d時，出愈率達95%。轉接9 d時F處理出愈率僅為51%，轉接后9～15 d，大量產生愈傷組織，第21天后愈傷組織誘導率為95%。高CO2條件下轉接試管苗9 d后，G1處理試管苗出愈率達85%，在第21天后全部處理出現愈傷組織。S1轉接第9天時，78%出現愈傷組織，在轉接后12～18 d愈傷組織生長迅速，18 d后趨于平穩。F1在9 d后出愈率為64%，9～15 d后愈傷組織生長大幅增長，18 d后生長速度趨于平穩。總體表現為：相同環境下，蔗糖處理對植株愈傷組織生長前期的促進作用最為顯著。同種糖處理下，高CO2濃度在試管苗轉接后能夠促進愈傷組織的生長，但在生長后期與正常CO2濃度處理愈傷組織生長趨于一致。

圖1 不同外源糖及CO2濃度處理對試管苗愈傷組織的影響Figure 1 Changes of different sugars and different concentration of CO2 on callus in vitro

2.2 高CO2濃度下不同糖類對試管苗生根的影響

高CO2環境下葡萄糖處理平均根長增加最為顯著，較其他兩種處理平均根長分別增長0.54 cm、1.02 cm。高CO2環境下G、S與F三個處理試管苗前30 d根長高于正常CO2濃度。正常處理平均根長為3.4 cm，高CO2處理平均根長為2.7cm。但在生長后期，高CO2濃度處理植株生長速度減緩，6個處理根長并無顯著差異（圖2）。

圖2 不同外源糖及CO2濃度處理下試管苗根長的變化Figure 2 Changes of different sugars and different concentration of carbon dioxide on root length in vitro

2.3 高CO2濃度下不同糖種類對試管苗株高的影響

高CO2濃度下18～24 d株高平均生長速度加快，平均值較正常處理分別增加2.33 cm、1.20 cm、1.00 cm。外源增施葡萄糖對植株生長促進作用明顯（圖3）。

圖3 不同外源糖處理及CO2濃度對試管苗株高的影響Figure 3 Effects of different sugars and different concentration of carbon dioxide on plant height in vitro

2.4 高CO2濃度下不同外源糖種類對試管苗可溶性蛋白質及葉綠素含量的影響

高CO2濃度處理下，G1與S1處理試管苗葉片可溶性蛋白質含量顯著高于F1處理，G1與S1可溶性蛋白含量無顯著性差異（圖4-A）。正常CO2濃度下F葉綠素含量分別高出其他兩種處理6.09、4.63。3種處理葉綠素相對含量由低到高依次為G、S、F。G1與S1葉綠素含量幾乎一致，由此可以看出，不同糖類處理的植株對CO2濃度反應不同。果糖處理植株葉片的葉綠素相對含量對CO2濃度的變化反應更為明顯。高CO2濃度對果糖處理植株葉綠素合成表現出抑制作用，從而使得葉綠素相對含量下降（圖4-B）。

圖4 不同外源糖及CO2濃度處理下試管苗葉片可溶性蛋白質含量和葉綠素含量Figure 4 Soluble protein content and chlorophyll content of different sugars and different concentration of CO2 in vitro

2.5 高CO2濃度下不同外源糖種類對試管苗葉綠素熒光參數的影響

高CO2濃度下，G1處理試管苗葉片電子傳遞速率大于其他兩處理（圖5-A）。正常條件不同糖處理試管苗葉片實際光量子產量（ΦPSII）從高到低依次為：G＞S＞F。高CO2下，蔗糖與果糖處理試管苗葉片ΦPSII均高于正常處理，而葡萄糖處理下葉片ΦPSII相比正常處理下降（圖5-B）。正常CO2條件下非光化學淬滅系數（NPQ）三種糖處理無顯著差異。高CO2三種糖處理NPQ顯著低于正常CO2處理，其中G1處理顯著低于其他處理（圖5-C）。葉片最大量子產量（Fv/Fm）在正常CO2處理下無顯著差異。在高濃度CO2的三種糖處理的Fv/Fm均高于正常CO2處理，其中S1與F1相比G1處理顯著升高（圖5-D）。

圖5 不同外源糖處理及CO2濃度對試管苗葉綠素熒光相關參數的變化Figure 5 Changes of chlorophyll fluorescence parameters of different sugars and different concentration of CO2 in vitro

3 討論與結論

植物組織培養中主要以蔗糖作為碳源。但不同植物對不同糖類的反應不完全相同[16]。蔗糖被植物吸收后被分解為己糖，蔗糖通過蔗糖合成酶（SS）催化生成果糖，經轉化酶（IVR）水解生成果糖與葡萄糖[17]；而酸性轉化酶（AI）和中性轉化酶（NI）將會催化蔗糖不可逆分解為果糖和葡萄糖[18]。本試驗發現：在高濃度CO2下，葡萄糖對單芽莖段愈傷組織的形成有明顯促進作用，而果糖對試管苗愈傷組織的形成促進作用較弱。

葡萄糖作為信號分子，通過糖酵解和線粒體磷酸化來調控葉片光合作用，促進根分生組織活性[19]。葡萄糖對試管苗根的生長有明顯的促進作用，這與前人的研究相一致，并且外源葡萄糖可以增加植株側根以及根毛數量[19-20]。葡萄糖可以通過糖酵解和線粒體生物能傳遞，驅動TOR信號傳導，從而快速控制根分生組織代謝轉錄網絡，活化細胞周期，進而促進根分生組織激活[21]。高CO2濃度下不同糖源對植株根系生長速度的影響表現出顯著差異。

本試驗結果進一步表明高濃度CO2還引起了不同糖源影響植株的實際光量子產量差異性表達。試驗還發現，在植株生長初期高CO2濃度處理促進試管苗生長，其長勢明顯優于正常處理植株，而在生長后期，CO2處理不再表現出明顯優勢。這可能是高CO2濃度負反饋調節呼吸代謝有關[22]，或者是因為植株對高CO2濃度環境產生了光和適應。而本試驗未涉及高CO2濃度對酸性轉化酶等相關酶對蔗糖分解速率的研究，這有待進一步探索。

葉片中可溶性蛋白含量的高低可以反映不同處理植株的氮素代謝水平。葉片中所含的可溶性蛋白主要包括以RuBp羧化酶為主的可溶性蛋白，參與卡爾文循環的相關酶，以及位于葉綠體類囊體膜上含有色素蛋白復合體的相關蛋白[13]。試驗發現在高CO2濃度環境中，蔗糖處理可溶性蛋白含量最高，這可能是由于CO2濃度的增加影響到了蔗糖的不可逆分解進程。

試驗通過統計第25天試管苗葉片葉綠素相對含量發現，果糖處理中葉綠素相對含量較高，說明果糖對植株葉片葉綠素的合成起到明顯促進作用。這說明外界CO2濃度影響到了不同糖在試管苗體內的代謝進程。

Fv/Fm可以反映PSII反應中心潛在光能轉化效率，即PSII反應中心均處于開放狀態時的量子產量。ΦPSII即線性電子傳遞的量子效率，也是PSII實際的電子傳遞的量子效率，其值用來反映電子在PSII與PSI的傳遞情況[23]。當PSII反應中心天線色素吸收了過量的光能時，如不能及時地耗散將對光合機構造成失活或破壞，所以非光化學淬滅是一種自我保護機制，對光合機構起一定的保護作用[24]。正常CO2條件三種糖處理NPQ應高于高CO2處理，說明高CO2能夠促進PSII反應中心吸收光能，降低過剩光能對光系統的破壞。根據彭長連等[25]的研究，高CO2濃度能夠提高PSII光化學活性，并且促進PSII電子傳遞的相對量子產量。增加葉綠素熒光光化學淬滅組分，降低非光化學猝滅組分。試驗發現在高CO2濃度下，葡萄糖處理電子傳遞量子效率實際光化學產量均低于其他兩種處理并表現出顯著差異。而其非光化學淬滅系數也低于其他兩種處理。說明葡萄糖處理對所吸收的過量光能的耗散能力較差，導致其光合機制被破壞，從而造成了其光化學效率降低。

根據試驗結果，葡萄糖對單芽莖段愈傷組織的形成有明顯促進作用，而果糖對試管苗愈傷組織的形成促進作用較弱。同時表明，葡萄糖對試管苗根的生長有明顯的促進作用。糖種類的不同還影響了植物體內不同糖的轉化速率以及相關糖轉化酶的活性。

不同CO2濃度對植株根系的生長速度表現出顯著差異。高CO2濃度可以刺激植株快速生長，并直接影響到植物光合作用效果。而本試驗中未涉及CO2濃度和不同糖濃度互相作用如何能夠構成試管苗的最適生長環境，這有待進一步探索。