血紅素加氧酶1在頸動脈重度狹窄支架植入術(shù)后的變化及意義

邱文娟，王建紅，王多姿，楊 樹，何 邦，袁曉帆，郭 蕾，郭富強(qiáng)，

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

頸動脈重度狹窄是臨床常見疾病，也是引起卒中的重要原因。神經(jīng)介入被認(rèn)為是最有效直接改善腦血流的手段廣泛用于臨床[1]。對于長期慢性形成的血管重度狹窄，突然的灌注增加也會有不利的一面，氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮損傷、炎性反應(yīng)、過度灌注[2]。許多動物實驗表明血紅素加氧酶1(HO-1)在缺血再灌注后可以被誘導(dǎo)表達(dá)增加，發(fā)揮抗炎、抗氧化及抗凋亡作用[3]。本文通過測定健康人群和頸動脈重度狹窄患者支架治療術(shù)前后HO-1、中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值的水平，分析HO-1在支架植入前后的變化情況，進(jìn)一步探討其與缺血再灌注的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年12月至2018年4月四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的頸動脈重度狹窄患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)過全腦血管造影(DSA)確診為頸動脈重度狹窄(狹窄大于70%)。②符合頸動脈狹窄介入治療操作規(guī)范(專家共識)[4]：頸內(nèi)動脈：> 70%且有癥狀；無癥狀的單側(cè)狹窄> 80%，雙側(cè)均狹窄> 70%；鎖骨下動脈：鎖骨下動脈狹窄(單側(cè)或雙側(cè))>70%；椎動脈：椎動脈狹窄(單側(cè)或者雙側(cè))≥70%。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病；頸動脈閉塞長度> 10 mm或者多處狹窄；狹窄血管合并血管畸形、動脈瘤；近期內(nèi)出現(xiàn)顱內(nèi)出血(3月內(nèi))或者大面積腦梗死(1月內(nèi))；造影劑過敏；合并嚴(yán)重心、肝、腎疾病。選取同時間段我院神經(jīng)內(nèi)科收治的無頸動脈狹窄的患者為對照組。所有患者均簽署知情同意，并經(jīng)院倫理委員會通過。兩組基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組基線資料比較

1.2 觀察指標(biāo)及檢測方法①記錄研究對象的各種基線資料，包括性別、年齡、血管危險因素(高血壓、糖尿病、冠心病、高血脂、吸煙、腦梗死病史)，所有病人均入院次日清晨空腹抽取肘靜脈血，常規(guī)檢查白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞(NEU)、淋巴細(xì)胞(LYM)、中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值(NLR)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、同型半胱氨酸、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)、總膽紅素(TBIL)。②HO-1檢測方法：血液采集：采集觀察組患者術(shù)前、術(shù)后1天、術(shù)后3天空腹靜脈血4 ml，分離血清，-80 ℃低溫保存。對照組采用同樣方法制備標(biāo)本。將樣本和標(biāo)準(zhǔn)物分別加入含有HO-1抗體的試劑(Human HO-1 ELISA KIT(茁彩生產(chǎn)))微孔中，徹底洗滌，然后加入顯色物質(zhì)TMB，在此過程中顏色將由藍(lán)色變?yōu)樽詈蟮狞S色，樣品中HO-1含量越多，顏色越深。用酶標(biāo)儀(型號，Multlskan Mk3，賽默飛世爾儀器有限公司)在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。③ HO-1計算：先繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找出相應(yīng)的濃度×稀釋倍數(shù)=樣本的實際濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料：正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗，偏態(tài)分布以M(Qu-QL)表示，組間比較采用秩和檢驗，重復(fù)測量數(shù)據(jù)比較采用方差分析及LSD-t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組術(shù)前和對照組HO-1的比較觀察組術(shù)前HO-1水平(52.75±26.78)ng/ml與對照組(56.27±15.72)ng/ml比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.58，P= 0.566)。

2.2 觀察組術(shù)前術(shù)后血清HO-1濃度比較觀察組術(shù)前、術(shù)后第1天、術(shù)后第3天血清中HO-1水平分別為(52.75±26.78)、(80.18±43.01)、(100.36±45.23)ng/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.952，P<0.001)；術(shù)后第1天和第3天HO-1均較術(shù)前升高(P< 0.001)，術(shù)后第3天較術(shù)后第1天升高(P< 0.05)。

2.3 觀察組術(shù)前術(shù)后外周血血炎性細(xì)胞水平比較

術(shù)后NEU和NLR較術(shù)前升高(P<0.05)，見表2。

表2 觀察組術(shù)前術(shù)后外周血炎性細(xì)胞水平比較

3 討論

頸動脈重度狹窄是臨床常見疾病，也是引起腦卒中的重要原因。它可以導(dǎo)致認(rèn)知、情緒障礙以及頭暈、頭昏等癥狀，并伴有腦血流量的下降、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)損害以及雙側(cè)大腦半球之間的聯(lián)系性下降[5，6]，頸動脈重度狹窄對腦血流的影響更大，單側(cè)頸動脈重度狹窄CT灌注成像顯示，患側(cè)腦血流量、腦血容量較健側(cè)減少，患側(cè)腦組織血供不足，自身調(diào)節(jié)已不能完全代償[7]，而經(jīng)皮血管成形支架植入治療能夠直接緩解血管狹窄，改善腦部的血液供應(yīng)，創(chuàng)傷小，安全性可靠，因而被廣泛應(yīng)用于臨床[8]，本研究觀察組的44例頸動脈重度狹窄患者均為出現(xiàn)臨床癥狀及疾病(頭暈、腦梗死)就診，經(jīng)過支架植入術(shù)治療，術(shù)后嚴(yán)格控制血壓及監(jiān)測生命體征，癥狀有所改善，術(shù)后無腦梗死、腦出血、再狹窄病例。

本研究對照組和觀察組術(shù)前HO-1水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，引起這種結(jié)果的原因可能與頸動脈重度狹窄患者對慢性缺血的耐受及部分側(cè)支循環(huán)循環(huán)的建立有關(guān)，頸動脈重度狹窄多為長期慢性過程，目前關(guān)于HO-1在腦缺血方面的研究多見于動物模型中的急性大腦中動脈及頸總動脈血管閉塞及再通[9～11]，目前尚缺乏其在頸動脈重度狹窄及類似的慢性過程的變化依據(jù)，本研究結(jié)果顯示，HO-1在頸動脈重度狹窄患者中水平和正常人差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示HO-1在慢性過程中無明顯變化，更多在于急性應(yīng)激，且與血壓、血糖、血脂、膽紅素?zé)o差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，頸動脈支架植入術(shù)后HO-1水平在第1天和第3天血清中含量均較術(shù)前明顯增加，提示支架植入術(shù)能改善大腦血流，再灌注的同時還能引起HO-1升高。慢性頸動脈重度狹窄患者的血運重建，血管內(nèi)皮損傷、血流量增加，可引起炎癥因子TNF-α，IL-6和IL-1β增加，它們相互作用[12]，產(chǎn)生細(xì)胞因子和粘附分子等炎癥介質(zhì)，損傷血管、神經(jīng)細(xì)胞[13]，除此以外，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致進(jìn)一步的細(xì)胞功能障礙，細(xì)胞凋亡，甚至死亡。各種因素如術(shù)后高血壓，手術(shù)時間延長，側(cè)支血流量減弱，狹窄的嚴(yán)重程度可能導(dǎo)致炎癥及應(yīng)激增加。而HO-1是誘導(dǎo)型酶，被證明在腦組織炎癥及氧化應(yīng)激時可升高[14]，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[15，16]，本研究支架植入術(shù)后HO-1水平升高，提示HO-1在頸動脈重度狹窄支架植入術(shù)后的急性應(yīng)激中可能發(fā)揮了保護(hù)性的作用，這國外動物及體外研究一致[17，18]。

本研究探討了支架植入術(shù)后不同時間的HO-1水平，結(jié)果顯示術(shù)后第3天HO-1較術(shù)前第1天升高，提示術(shù)后第3天HO-1水平發(fā)生了改變，有研究顯示在動物缺血再灌注2 h，6 h和24 hHO-1的表達(dá)均增加，HO-1 mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)也增加[19]，本研究在人體頸動脈重度狹窄支架植入術(shù)后第3天血清中測得HO-1水平較術(shù)后第1天增加，與國外動物實驗?zāi)X組織測得的HO-1水平增加相似[20]，由于本研究中無再灌注損傷患者，HO-1水平與再灌注損傷的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

研究中還檢測了NLR，NLR作為一種新的炎性標(biāo)記物，正被越來越多的應(yīng)用于臨床研究中[21]，炎性反應(yīng)是缺血再灌注損傷的重要過程，而中性粒細(xì)胞在其中發(fā)揮著核心作用，內(nèi)皮損傷、氧化應(yīng)激可引起中性粒細(xì)胞的聚集、活化，釋放炎癥介質(zhì)、炎癥因子以及蛋白水解酶，從而引起內(nèi)皮損傷、血腦屏障破壞、神經(jīng)損害[22，23]，因此中性粒細(xì)胞可作為炎性反應(yīng)的指標(biāo)。研究顯示，在炎性反應(yīng)過程中，淋巴細(xì)胞的變化與中性粒細(xì)胞變化相反，淋巴細(xì)胞相對減少，為機(jī)體的保護(hù)性及調(diào)節(jié)指標(biāo)[24]，相比前兩者，NLR更能反映炎癥情況，具有更好的代表性。本實驗測得術(shù)后NLR較術(shù)前增加，顯示支架術(shù)后存在一定程度的炎性反應(yīng)，可能與術(shù)后血流量的突然改變及內(nèi)皮損傷有關(guān)，而炎性反應(yīng)可能作為誘導(dǎo)刺激引起具有保護(hù)作用的HO-1的增加，進(jìn)而發(fā)揮抗炎的作用。

本研究得出支架植入術(shù)能改善頸動脈重度狹窄，血流再灌注后HO-1水平升高，但血清中HO-1增加可被其他系統(tǒng)性疾病及手術(shù)時間、術(shù)后血壓水平、感染、支架本身等影響，為減少干擾因素，本研究排除了一些常見其他慢性病及慢性血管重度狹窄對HO-1水平的影響，在篩選觀察組病例時排除了合并系統(tǒng)性疾病的病例(慢性阻塞性肺疾病、心肌梗死、不穩(wěn)定心絞痛、腦出血、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病)，入組病例手術(shù)均順利，手術(shù)時間控制在40～60 min，術(shù)后均嚴(yán)格控制收縮壓120～140 mmHg，術(shù)前術(shù)后無明顯感染(肺部、顱內(nèi)、腹部、泌尿系統(tǒng)、皮膚等)，因此在一定程度上可反應(yīng)血流改善后的HO-1變化趨勢。

本研究中以頸動脈重度狹窄患者為研究對象，通過支架植入術(shù)實現(xiàn)大腦缺血再灌注，并測定術(shù)前和術(shù)后血清HO-1水平，較國外利用動物大腦中動脈完全閉塞再通的實驗?zāi)Ｐ鸵约皬哪X組織中檢測HO-1水平的研究有所不同[25]，但研究結(jié)果與之相似，均測得HO-1水平較再灌注前升高，且有增高趨勢，可能存在時間依耐性。本研究不足之處在于，樣本量較少，無法排除支架本身的影響，未同步檢測涉及HO-1上游表達(dá)相關(guān)基因和蛋白及炎癥因子和氧化物質(zhì)變化情況，對于引起HO-1變化的分子機(jī)制未做研究。

綜上，通過頸動脈重度狹窄患者動脈介入治療可改善顱內(nèi)動脈供血，從而升高患者保護(hù)性因子HO-1水平，可能是反映缺血再灌注損傷的指標(biāo)之一，其再灌注損傷的閾值有待進(jìn)一步研究。