60Co-γ輻照對花生過敏原Ara h 2蛋白構象及致敏活性的影響

羅春萍 胡純秋

(1 臺州科技職業學院，浙江 臺州 318020；2 安徽醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，安徽 合肥 230032)

花生是一種營養豐富且深受人們喜愛的食物，也是世界公認的八大過敏原食物之一[1]。近年來的流行病學研究表明，花生過敏影響了1%～2%的世界人口，各國花生過敏人數呈現明顯上升趨勢，花生過敏反應的危害性和長期性已嚴重影響了花生過敏人群的生活質量[2-4]。Ara h 2蛋白是花生致敏性最強的組分之一，由分子量為16.7 kDa和18 kDa的2個亞型蛋白組成，約占花生蛋白總量的5.9%～9.3%[5-6]。過敏反應的物質基礎是表位，表位可分為線性表位和構象性表位，線性表位由5～7個連續氨基酸組成，構象性表位可由分布于肽鏈不同部位或不同肽鏈的15～22個氨基酸構成，與蛋白質的空間構象密切相關[7]。在Ara h 2的空間折疊結構中，5個α-螺旋結構構成基本骨架，并以4個保守的二硫鍵連接α-螺旋結構以穩定構象，對過敏原構象性表位的結構穩定性發揮重要作用[8]。此外，Ara h 2.01含有10個過敏原線性表位，Ara h 2.02比Ara h 2.01多一個DPYSPS的線性表位，它們能與花生過敏患者血清中的相應抗體結合，引發致敏反應[8-9]。

輻照技術作為一項常用的食品非熱加工技術，被廣泛地應用于食品保藏、品質改善、消毒滅菌等方面[10]。近年來，利用輻照對過敏食品進行脫敏的技術也受到了廣泛關注[11]。研究發現，輻照能引起蛋白質氨基酸序列的斷裂、交聯和分子構象的改變，導致過敏原表位的破壞，進而影響過敏原與相應抗體的結合能力，改變過敏原的致敏性，有可能成為降低或消除食物過敏反應的重要技術[12-14]。王爍等[15]用60Co-γ輻照處理花生溶液，發現1.0 kGy以下的小劑量輻照處理對花生溶液中的致敏蛋白影響不大；當輻照劑量在1.0 kGy以上時，花生各蛋白含量普遍減少，說明輻照處理能降低花生的致敏性并與輻照劑量關系密切。許舒婷等[16]曾用電子束輻照處理花生過敏原液和脫脂花生粉，發現輻照能較大程度地降低液體狀態下的花生過敏原致敏性，但對花生粉中的過敏原影響較小。目前，輻照去除或減少花生過敏原的研究和應用尚處于發展階段[11]，輻照過程中花生過敏原結構與表位的變化規律和機理有待深入研究。因此，本研究選取花生過敏原中過敏原表位和三維結構均較明確的 Ara h 2 為試驗對象，評估60Co-γ輻照處理后Ara h 2蛋白的結構與抗原性變化，探討花生過敏原輻照變化的規律與機理，以期為輻照在花生脫敏中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮花生，購自南昌市青山湖農貿市場；DEAE-Sepharose Fast Flow，美國GE公司；PVDF膜，美國Millipore公司；兔抗Ara h 2 多克隆抗體(效價1∶100 000)，南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室自制[17]；4-氯-1-萘酚、OPD、HRP標記羊抗兔IgG二抗等，美國Sigma公司；96孔酶標板，深圳金燦華公司。其他試驗試劑均為國產分析純。

Ara h 2的過敏原線性表位與α-螺旋結構的氨基酸序列見圖1[8-9]。

圖1 Ara h 2的過敏原線性表位與α-螺旋結構的氨基酸序列Fig.1 Sequence of linear epitopes and α-helix of Ara h 2

1.2 主要儀器與設備

MA99-1自動核酸蛋白分離層析儀，上海青浦滬西儀器廠；60Co-γ輻照源，江西省農業科學院原子能應用研究所；Mini-protean 3蛋白垂直電泳槽、PowerPac 3000電泳儀、Trans-Blot SD Cell電轉儀、Mode 1860酶聯免疫檢測儀，美國Bio-Rad公司；UV-VS 2501PC紫外分光光度計，日本島津公司；J-810圓二色譜儀，日本JASCO公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生過敏原Ara h 2的分離純化 參照胡純秋[17]的方法。新鮮花生仁研磨成粉末，用丙酮脫脂，50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH值7.2)浸提得花生蛋白溶液。將花生蛋白溶液過DEAE-Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱分離，50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH值7.2)為淋洗液，得到花生過敏原Ara h 2溶液，再將Ara h 2溶液用Amicon Ultra-15超濾離心管(截留分子量3.0 kDa)濃縮，-20℃保存備用。采用SDS-PAGE電泳對Ara h 2溶液的純度及分子量進行分析檢測，并用Bradford法測定Ara h 2溶液的濃度。

1.3.2 花生過敏原Ara h 2蛋白濃度的測定 采用Bradford法[18]測定Ara h 2蛋白濃度，并以牛血清白蛋白為標準蛋白制作標準曲線，檢測波長為595 nm。

1.3.3 輻照處理 輻照處理在江西省農業科學院原子能應用研究所進行，將純化的Ara h 2溶液用50 mmol·L-1、Tris-HCl緩沖液(pH值7.2)稀釋成0.2 mg·mL-1，每管40 mL分裝密封于離心管中，然后采用60Co-γ輻照裝置于室溫(25℃左右)下進行輻照處理，輻照劑量分別為0、1、3、5、10、15、20、25 kGy，劑量率為8.65 Gy·min-1。每個劑量設3次重復，輻照后所有樣品立即儲存于-20℃備用，檢測也均重復3次。

1.3.4 輻照處理對Ara h 2蛋白結構的影響 取適量0.2 mg·mL-1Ara h 2蛋白溶液，于室溫(25℃左右)條件下，采用紫外分光光度計分析Ara h 2蛋白的結構。波長掃描范圍為190～400 nm、間隔1 nm、掃描速度為100 nm·min-1。

1.3.5 輻照處理對Ara h 2蛋白二級結構的影響 取適量0.2 mg·mL-1Ara h 2蛋白溶液，于室溫(25℃左右)、氮氣吹掃條件下，采用圓二色譜儀測定Ara h 2蛋白的二級結構。遠紫外波長掃描范圍為190～250 nm，間隔1 nm，掃描速度為100 nm·min-1，光徑為1 mm。每個樣品圓二檢測3次，結果取平均值。測定結果用氨基酸殘基摩爾橢圓率(mean residue ellipticity，MRE，[θ])表示，單位為deg·cm2·dmol-1，按照下列公式計算[19]：

[θ]=θλ×(M/氨基酸殘基數)/(C×L)

(1)

式中，θλ為CD觀察值，mdeg；M為蛋白質分子量；C為蛋白濃度，mg·mL-1；L為光徑，mm。

1.3.6 輻照處理對Ara h 2分子量的影響 將輻照處理前后的Ara h 2溶液與2×上樣緩沖液等體積混合制成電泳樣品，100℃煮沸離心后上樣。SDS-PAGE電泳采用不連續體系，使用15%分離膠和5%濃縮膠；恒流電泳：濃縮膠6 mA恒流20 min，分離膠12 mA恒流。采用考馬斯亮藍R-250染色并用數碼相機拍照，備用。

1.3.7 輻照處理對Ara h 2抗原性的影響 1)免疫印跡法。輻照處理前后的Ara h 2 蛋白溶液經SDS-PAGE電泳分離后用Bio-Rad電轉儀轉至PVDF膜上，電轉條件：室溫條件下50 mA恒流電轉2 h。轉印后的PVDF膜用1% TBST溶液(含1%吐溫-20的TBS溶液)室溫振蕩封閉1 h，TBS (含50 mmol·L-1Tris-HCl、150 mmol·L-1NaCl，pH 值7.5)洗滌3次后加入兔抗Ara h 2 血清(1∶5 000 TBS稀釋)，4℃反應過夜。次日取出PVDF膜，TBS洗滌3次后加HRP酶標羊抗兔IgG二抗(1∶5 000 TBS稀釋)，室溫振蕩反應2 h。反應結束后，TBS洗滌PVDF膜3次，加入4-氯-1-萘酚顯色液(含20 mL TBS、12 mg 4-氯-1-萘酚、4 mL乙醇、12 μL 30% H2O2)室溫避光顯色。待出現明顯條帶后，蒸餾水終止反應，并用濾紙吸干，數碼相機拍照并保存結果。以普通兔血清代替兔抗Ara h 2 血清作為陰性對照，以排除假陽性反應。

2)間接ELISA法。將輻照處理前后的Ara h 2溶液用包被液(含15 mmol·L-1Na2CO3、35 mmol·L-1NaHCO3，pH值9.6)稀釋成1.25 μg·mL-1，在同一酶標板上每孔包被100 μL，每個樣品包被3個孔，4℃包被過夜。次日取出酶標板，用PBST(含1%吐溫-20的100 mmol·L-1pH值7.0磷酸鹽緩沖液)，每孔250 μL洗滌3次后，加入5%脫脂乳封閉液(PBS稀釋)，每孔250 μL，37℃恒溫封閉1 h。PBST洗滌后加入兔抗Ara h 2血清(1∶10 000 PBS稀釋)，每孔100 μL，37℃恒溫反應1 h。洗滌后加入HRP酶標記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000 PBS稀釋)，每孔100 μL，37℃恒溫反應 1 h。反應結束后，PBST再洗滌3次，加入OPD顯色液[含0.5 mg·mL-1OPD、0.03%H2O2、100 mmol·L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH值5.5)]，每孔100 μL，37℃恒溫避光顯色15 min，2 mol·L-1H2SO4溶液(每孔50 μL)終止反應，用酶標儀測定各孔在490 nm處的OD值，并計算不同劑量輻照處理后的IgG結合能力：

IgG結合能力=B/B0×100%

(2)

式中，B0為0 kGy輻照處理樣品OD490值；B為輻照處理樣品OD490值。

1.3.8 數據分析 采用Microsoft Excel 2010對所得數據進行作圖分析，并采用SPSS 18.0軟件檢驗組間差異顯著性，P<0.05表示顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 輻照處理對Ara h 2 蛋白結構的影響

由圖2可知，未輻照(0 kGy)組Ara h 2蛋白有2個吸收峰，分別在210 nm和275 nm處，其中210 nm處的吸收峰主要是由Ara h 2肽鍵上C=O的n→π*躍遷引起的，與Ara h 2肽鍵C=O含量有關。Ara h 2分子中含有1個色氨酸(Trp)和4～5個酪氨酸(Tyr)(圖1)[8-9]，色氨酸和酪氨酸芳香環的π→π*和n→π*躍遷是引起Ara h 2蛋白275 nm處吸收峰的主要原因[20]。輻照處理后，210 nm和275 nm處的吸收峰均出現顯著增色效應，且輻照劑量越大，強度越強。210 nm處峰位向高波數微小位移(紅移)，275 nm峰位略向低波數位移(藍移)，表明輻照處理可使Ara h 2蛋白肽鏈伸展，蛋白質分子內部的酪氨酸和色氨酸殘基暴露，顯示為275 nm處的吸收峰增強，且隨著輻照劑量的增加，酪氨酸和色氨酸殘基暴露的越多，對 Ara h 2 蛋白的影響也越大；同時暴露出來的酪氨酸和色氨酸具有疏水性，使蛋白分子之間疏水作用增強，π→π*和n→π*躍遷能量增大，導致峰位向低波數微小位移，可見輻照處理使Ara h 2發生了構象改變。此外，210 nm處吸收峰的增強說明了Ara h 2蛋白羰基含量的增加，輻照過程中產生的羥基自由基易作用于側鏈帶有-NH和-NH2的氨基酸[21]，使其發生脫氨反應產生羰基，而羰基碳原子與羥基自由基相連則使該吸收峰輕微紅移。

圖2 不同劑量輻照處理下Ara h 2蛋白的紫外光譜圖Fig.2 UV absorption spectra of Ara h 2 protein under different doses of irradiation treatment

2.2 輻照處理對Ara h 2蛋白二級結構的影響

圓二色光譜(circular dichroism，CD)是研究溶液中蛋白質構象變化的一種簡單、快速、準確的方法[22]。190～250 nm的遠紫外光譜區，圓二色性主要由肽鍵的n→π*電子躍遷引起，能夠反映蛋白質或多肽鏈二級結構的信息[23]。由圖3可知，CD顯示了天然Ara h 2蛋白在195 nm處有一個正峰，208 nm和222 nm各有一個負峰，這是α-螺旋結構的3個特征峰[24]，即 Ara h 2 具有典型的α-螺旋結構，這與Mueller等[9]的研究結果相符。隨著輻照劑量的增加，208、222 nm處負峰均減弱，并略向低波數移動，可見α-螺旋結構含量的減少。這是因為輻照產生的自由基作用于Ara h 2蛋白，引起肽鍵C=O的n→π*躍遷，破壞維持α-螺旋結構的氫鍵和二硫鍵，使規則二級結構中肽鍵排列的方向改變，從而引起Ara h 2蛋白二級結構的變化。當輻照劑量達到10、15 kGy時，195 nm正峰和208、222 nm負峰均相當薄弱，直至20、25 kGy輻照處理后，Ara h 2 蛋白的CD光譜峰接近消失，α-螺旋結構幾乎消失，表明10、15、20、25 kGy輻照處理對Ara h 2蛋白二級結構產生了極大的破壞。

圖3 不同劑量輻照處理下Ara h 2 蛋白的圓二色譜圖Fig.3 Circular dichroism spectra of Ara h 2 protein under different doses of irradiation treatment

由圖4可知，Ara h 2蛋白經輻照引起的α-螺旋結構208 nm特征峰的強度減弱，與UV 275 nm的峰強度增強呈現良好的相關性，相關系數為0.921，表明α-螺旋含量的減少與酪氨酸、色氨酸殘基的暴露呈正相關。綜上，在輻照過程中Ara h 2蛋白的結構變化呈現一定的規律性。

圖4 不同劑量輻照處理下Ara h 2蛋白的圓二色譜與紫外光譜的相關性分析Fig.4 Correlation analysis between circular dichroism spectra and UV absorption spectra of Ara h 2 protein under different doses of irradiation

2.3 輻照處理對Ara h 2蛋白分子量的影響

由圖5可知，天然Ara h 2蛋白的分子量為16、18 kDa，這與Marsh等[25]的報道一致。輻照處理后花生Ara h 2蛋白條帶發生了顯著變化，16 kDa和18 kDa蛋白條帶顏色隨著輻照劑量的增加而變淺，且在10 kGy時條帶消失，同時Ara h 2蛋白產生了一些高分子量的化合物，多數聚合物堆積在分離膠的頂部，甚至存在于濃縮膠中，無法進入到分離膠，且1、3 kGy處理出現了部分34 kDa的聚合物。綜上所述，輻照產生的能量能打斷肽鏈，產生蛋白亞基，而這些亞基片斷可能重新交聯產生了分子量較大的聚合物，即輻照處理使 Ara h 2 蛋白發生了降解和交聯。

注：M：預染標準蛋白。下同。Note: M: Prestained marker. The same as following.圖5 不同劑量輻照處理下Ara h 2 蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE patterns of Ara h 2 protein under different irradiation doses

2.4 輻照處理對Ara h 2抗原性的影響

圖6中泳道2只出現16 kDa和18 kDa 2個印跡條帶，而陰性兔血清的免疫印跡圖譜上無任何條帶(結果未列出)，說明Ara h 2抗體能特異性地識別 Ara h 2 蛋白及其表位，與花生中的其他過敏原均無反應。輻照Ara h 2蛋白免疫印跡圖與電泳圖的一個明顯變化是，看不到分離膠頂部的印跡條帶，其原因可能是輻照破壞了Ara h 2蛋白的表位，從而在膜上無法與抗體反應，也可能是形成的聚合物分子量過大，無法從電泳凝膠轉印至膜上?？傮w來說，免疫印跡條帶的消失說明輻照處理可以破壞Ara h 2蛋白與兔抗Ara h 2蛋白多克隆抗體(IgG)結合的活性。

圖6 不同劑量輻照處理下Ara h 2蛋白的免疫印跡圖Fig.6 Western blotting of Ara h 2 protein under different irradiation doses

為進一步檢測輻照處理對Ara h 2蛋白免疫活性的影響，采用間接ELISA方法定量測定輻照處理后Ara h 2蛋白與Ara h 2抗體的結合能力(圖7)。結果表明，隨著輻照劑量的增大，Ara h 2蛋白與抗體的結合能力降低，當輻照劑量為5 kGy時，Ara h 2蛋白的IgG結合能力降低了66%；輻照劑量為10～25 kGy時，Ara h 2蛋白的IgG結合能力均降至10%以下，這與免疫印跡得到的結果一致，說明輻照處理破壞了Ara h 2蛋白的表位，使其失去與抗體結合的能力；輻照劑量為5 kGy時可較大程度破壞Ara h 2蛋白表位，10～25 kGy輻照處理后Ara h 2蛋白基本喪失免疫活性。此外，輻照劑量增大引起的Ara h 2的抗原性減弱與CD 208 nm峰強度的降低有良好的相關性，相關系數為0.842。同時，比較Ara h 2的抗原性減弱與UV 275 nm的峰強度增強的趨勢，得出兩者相關系數為0.961，相關度更高，說明輻照處理使Ara h 2蛋白的有序結構轉為無序，引起過敏原表位無法與Ara h 2抗體結合，失去免疫活性。

圖7 不同輻照劑量下Ara h 2的IgG結合能力與Ara h 2 α-螺旋含量變化Fig.7 Changes of IgG binding abilities and α-helix content of Ara h 2 protein under different irradiation doses

3 討論

3.1 輻照處理對Ara h 2蛋白構象的影響

在液體狀態下60Co輻照產生的γ射線激活水分子產生水合電子、羥基和氫基自由基作用于氨基酸、多肽等生物分子，使它們發生脫氨、脫羧、氧化反應，引起蛋白質降解、交聯和分子構象的改變，是輻照引起蛋白質結構變化的主要原因[26-27]。輻照處理后Ara h 2蛋白在210、275 nm處的紫外吸收強度的顯著變化及208、222 nm處圓二色光譜的改變，表明蛋白質肽鍵、色氨酸、酪氨酸殘基都是輻照自由基對蛋白質進行攻擊的位置，這種攻擊導致了Ara h 2蛋白發生聚合作用和片段化，顯示為輻照強度增強的條件下，分子量為16 kDa和18 kDa的條帶幾乎消失，并出現大分子聚合物。

胡欣欣[28]發現在較多羥基自由基存在的條件下，酪氨酸易被氧化為二聚酪氨酸，使蛋白分子發生集聚。Ara h 2蛋白分子具有較多的酪氨酸，其水溶液經輻照處理后產生的羥基使Ara h 2蛋白出現降解和交聯現象，且輻照強度增強時Ara h 2蛋白在275 nm處的特征峰顯著增強，故可推測Ara h 2蛋白在輻照過程中形成聚合物的主要原因可能是因為形成了二聚酪氨酸。

3.2 輻照處理對Ara h 2蛋白致敏活性的影響

蛋白質引起致敏的前提是其具有抗原性。本研究結果表明，隨著輻照劑量的增大，Ara h 2蛋白與抗體的結合能力降低，說明輻照能破壞Ara h 2蛋白的抗原性，降低蛋白質的致敏性，類似的結果也出現在 Ara h 6 和其他花生過敏原蛋白中[16,29]。此外，Byun等[30]、Meng等[31]也證實輻照能破壞蝦原肌球蛋白、雞蛋卵白蛋白、牛奶β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的過敏原表位，導致致敏性的消減。

過敏原表位是蛋白質具有抗原性的關鍵性因素，是抗原與抗體特異性識別的基本單位。Ara h 2蛋白具有10～11個線性過敏原表位，Barre等[8]和Mueller等[9]發現色氨酸和酪氨酸均位于Ara h 2 蛋白分子的過敏原表位上，α-螺旋結構對Ara h 2 蛋白表位功能的發揮起著重要的作用。通過紫外光譜和圓二色光譜分析發現，輻照處理引起了Ara h 2蛋白色氨酸、酪氨酸殘基和α-螺旋含量的變化，這些變化均與Ara h 2蛋白與抗體結合能力的降低呈現高度的相關性，說明輻照處理導致了Ara h 2蛋白變性、交聯和構象的改變，破壞了其過敏原表位，導致蛋白抗原性降低，破壞蛋白質本身的致敏性。

3.3 輻照劑量對Ara h 2構象及致敏活性的影響

本研究中，當輻照劑量達到10 kGy時，溶液中 Ara h 2 蛋白的結構基本已被破壞，幾乎喪失了與抗體結合的能力，而繼續增加輻照劑量，其結構與抗原性的改變均不顯著，即輻照劑量為10 kGy時就能達到有效破壞Ara h 2蛋白結構和致敏活性的目的。同樣， Ara h 6 蛋白在輻照劑量達到10 kGy時其在溶液中與抗體結合的能力也基本消失[29]。許舒婷等[16]發現電子束輻照可以降低混合花生蛋白提取液的致敏性，Ara h 2 蛋白條帶在輻照劑量達到15 kGy時完全消失，其他蛋白條帶也均明顯變淺，而在劑量達到20 kGy時，脫脂花生粉末的致敏性才開始降低。因此，下一步研究的重點應是綜合考慮花生過敏原的存在狀態等因素，在控制輻照劑量的同時最大限度地降低花生過敏原的致敏性。

4 結論

60Co-γ輻照處理可顯著改變溶液中花生過敏原Ara h 2蛋白的結構和抗原性，使其在275 nm處的紫外吸光度增強，α-螺旋含量降低，并形成蛋白交聯。隨著輻照劑量的增加，Ara h 2蛋白與抗體的結合能力降低，且輻照處理后Ara h 2蛋白的結構變化與其抗原性變化是高度相關的，說明輻照處理改變了蛋白質的特定氨基酸或肽鍵的組成，導致Ara h 2蛋白變性，破壞了蛋白質與抗體的結合能力，降低了蛋白質的致敏性。此外，輻照劑量為10 kGy時可基本破壞溶液中Ara h 2蛋白的免疫活性。綜上，輻照處理能降低花生過敏原的致敏性，可作為花生過敏原脫敏的新方法，但要達到良好的輻照脫敏效果并開展實際應用，仍需進一步深入研究。