桂圓酵素的發酵工藝優化及其酚類化合物生物轉化分析

潘梓源，林佳漫，鄧乃銓，龔偉軍，葉燕妮，鄭 萱，姜翠翠，周英彪*

（1.廣東石油化工學院 廣東省嶺南特色果蔬加工及應用工程技術研究中心 廣東普通高校食品科學創新團隊，廣東 茂名 525000；

2.廣東石油化工學院 生物與食品工程學院，廣東 茂名 525000）

桂圓（Dimocarpus longganaLour.）又稱龍眼，為無患子科龍眼屬植物。桂圓樹為常綠喬木，食用部分是假種皮，乳白或淡白色，肉質脆，清甜[1-2]。其果肉含有多種營養物質，有補血安神、健腦益智、補養心脾的功效，是健脾長智的傳統食物，對失眠、心悸、神經衰弱、記憶力減退、貧血及抗衰老等有益[2-3]。我國桂圓產業規模化、產品系列化正在形成，傳統產品形式為鮮果、桂圓干及桂圓肉干[4]，深加工產品如桂圓果汁[5]、桂圓果酒[6-7]、桂圓果醋[2，8-9]、發酵飲料[10-11]及酵素[12]等也有研究開發。

酵素是近年在歐美日韓等經濟體中新興的一種產品形式，在我國也極具市場潛力。酵素按用途可分為食用酵素、環保酵素、日化酵素及飼用酵素。其中，食用酵素是指以動物、植物及菌類為原料，經微生物發酵而制得具有特定生物活性成分可食用的產品[13]。其中對生物現象有影響的微量或少量物質生物活性成分包括多糖類、寡糖類、蛋白質及多肽類、氨基酸類、維生素類及醇、酯、酸、酚類等[14]。

酚類化合物是多羥基酚類化合物的總稱，主要包括類黃酮和酚酸兩大類，酚類化合物具有很強的抗氧化作用，被稱為“第七類營養素”，除了抗氧化功能外，還有降血脂、抗癌、抗炎癥和凝聚血小板等功能，是近年功能性食品領域熱點研究的生物活性因子[15-16]。水果酚類化合物主要包括單寧或鞣質及小分子酚酸類化合物，如花青素、兒茶素、阿魏酸、沒食子酸和鞣花酸等[17]。桂圓果肉中含有多種游離態和結合態酚類化合物[18]，其中已經鑒定的酚類化合物有沒食子酸、綠原酸、兒茶素、表兒茶素、4-甲基兒茶酚、蘆丁、槲皮素、柯里拉京（Corillagin）、香豆酸、香草酸、原花青素三聚體A型、短鏈苯甲酰甲酸甲酯及鞣花酸等[19-23]。研究表明，酚類化合物，除了水果中本身自有外，也可通過微生物發酵的全細胞催化作用轉化生成[24]，例如乳酸菌發酵桂圓水提液可以增加發酵液中游離態總酚和總黃酮含量，降低結合態總酚和總黃酮含量[25]。

近年來，桂圓發酵飲料及酵素的相關研究也有報道。如龐澤翀等[26]對龍眼乳酸菌發酵飲料工藝進行了優化；葛瑞宏等[12]以胞外多糖含量為評價指標，優化了桂圓水提液乳酸菌酵素的發酵工藝；KHANSA等[22]分析了桂圓水提液乳酸菌發酵液中酚類化合物及游離氨基酸組成和抗氧化潛力。本研究以桂圓水提液為原料，總酚含量為評價指標，采用單因素及正交試驗優化桂圓酵素的發酵工藝；并采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析了桂圓酵素中酚類化合物的生物轉化情況，為進一步研究闡明其轉化機制，進而為定向研究開發富含特定酚類化合物并且具有特定功能的桂圓酵素奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干制桂圓肉：產自廣東省高州市；釀酒酵母（Saccha romycescerevisiae）CGMCC2.3853：中國普通微生物菌種保藏管理中心；醋酸桿菌（Acetobacterpasteurianus）CICC20064、植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC21790：中國工業微生物菌種保藏管理中心。

綠原酸、阿魏酸、柚皮苷、柚皮素、橙皮素、沒食子酸標準品（均為色譜純）：北京索萊寶科技有限公司；乙酸乙酯（色譜純）、甲醇（色譜純）：德國默克公司；福林-酚試劑（分析純）：福州飛凈生物技術有限公司；Na2CO3（分析純）：購自天津市百世化工有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%；LB培養基：酵母粉0.5%，蛋白胨1%，NaCl 1%。培養基均在121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

WJS1222F型榨汁機：美的電器公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋：國華電器公司；DHZ-DA型臥式恒溫搖床：蘇州培英公司；RE-2000A旋轉蒸發儀：上海亞榮公司；YP10002電子天平：上海佑科公司；SPT-16A全自動氮空吹掃濃縮儀：北京斯珀特公司；Gene1580R臺式高速冷凍離心機：基因有限公司；L5S型紫外可見分光光度計：上海儀電公司；LC-20AT高效液相色譜：日本島津公司；InertSustain C18色譜柱：日本GL Sciences公司。

1.3 方法

1.3.1 桂圓酵素的制作工藝與操作要點

蒸餾水 菌種培養→離心去上清↓↓

干制桂圓肉→粉碎→熱水浸提→過濾→水提液→接種菌體→發酵→靜置澄清→上清離心過濾→桂圓酵素

操作要點：

桂圓水提液的制備：取干制桂圓肉打碎成粉末狀，按料液比1∶10加入蒸餾水，70℃水浴浸提1 h，無菌紗布過濾去渣后，獲得桂圓水提取液。

菌株培養：分別培養釀酒酵母（YPD培養基，接種量0.1%，30℃、180 r/min振蕩培養）、醋酸桿菌（LB培養基，接種量0.1%，30℃、180 r/min振蕩培養）與植物乳酸桿菌（LB培養基，接種量0.1%，37℃、180 r/min振蕩培養）至對數生長中后期。

接種發酵：按10%接種量量取菌液，10 000 r/min、4℃條件下離心10min，棄上清液取菌體，無菌生理鹽水洗滌菌體2次（重懸菌體后離心棄上清液）。桂圓水提取液分裝每瓶120 mL，按單因素及正交試驗要求接入相應的菌株或組合菌株，培養發酵。

離心與過濾除菌：發酵液靜置澄清2h后，取上清8000r/min離心10 min，取上清0.45 μm濾膜過濾，即得桂圓酵素。

1.3.2 桂圓酵素發酵工藝優化單因素試驗

分別考察菌株組合（①釀酒酵母；②醋酸桿菌；③植物乳酸桿菌；④釀酒酵母＋醋酸桿菌；⑤釀酒酵母＋植物乳酸桿菌；⑥醋酸桿菌＋植物乳酸桿菌；⑦釀酒酵母＋醋酸桿菌＋植物乳酸桿菌）、發酵溫度（28℃、30℃、32℃、34℃、36℃及38℃）及發酵時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h及72 h）對發酵培養后桂圓酵素中的總酚含量的影響。初始發酵條件為：菌株組合比例1∶1和1∶1∶1，桂圓水提取液量120 mL，接種量10%（菌株活化培養與洗滌后接入菌體），發酵溫度30℃，轉速180 r/min，發酵時間24 h。

1.3.3 桂圓酵素發酵工藝優化正交試驗

依據單因素試驗結果，選取菌株組合、發酵溫度及發酵時間3個因素進行3因素3水平正交試驗，以發酵培養后桂圓酵素中的總酚含量為評價指標，確定最優桂圓酵素發酵工藝。

1.3.4 總酚含量測定

按照參考文獻[27]以OD765nm值（x）為橫坐標，以沒食子酸質量濃度（y）為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線y=8.514 9x-0.499 2，R2=0.996 2。

樣品總酚含量的測定：預試驗確定樣品合適的稀釋倍數后用蒸餾水稀釋樣品，量取稀釋樣品0.25 mL于10 mL具塞的定容試管中，加入福林-酚試劑1 mL及質量分數為12%的Na2CO3溶液2 mL，蒸餾水定容至10 mL，室溫下避光反應1 h，測定OD765nm值，依據標準曲線回歸方程確定樣品中總酚含量。

1.3.5 HPLC分析桂圓酵素中的酚類化合物

酚類化合物的萃取：取樣液（桂圓水提液或發酵液）50 mL，8000r/min離心20min，取上清液于80℃水浴10min，再次8000r/min離心20min，去除沉淀的雜蛋白，取上清液。將得到的上清液用1 mol/L的鹽酸溶液調整pH值至2.0，然后加入20 mL乙酸乙酯萃取，振蕩5 min后靜置分離有機相和水相，保留有機相；取水相加入20 mL乙酸乙酯重復萃取1次，保留有機相；兩次萃取后的水相，加入6.0 mol/L的NaOH溶液調pH值至6.0，加入20 mL乙酸乙酯萃取，振蕩5 min后靜置分離有機相和水相，保留有機相[28]。將所有有機相合并，于旋轉蒸發儀中30℃下旋轉蒸發至約3mL左右，然后于氮吹儀中接入氮氣吹干，用甲醇（色譜純）反復沖洗并定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后，進行HPLC分析。

酚類化合物標準品配制：精密稱取標準品綠原酸、阿魏酸、柚皮苷、柚皮素及橙皮素各0.001 0 g，分別用超純水溶解，并定容至10mL，取1mL過0.22μm濾膜后，進行HPLC分析。

HPLC檢測酚類化合物：用島津LC-20AT高效液相色譜儀對酚類化合物標準品、桂圓水提液及發酵液中酚類化合物進行檢測，檢測條件：C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）。洗脫方案：雙溶劑梯度流動相為超純水（A）和甲醇（B）。梯度設定為：0～20 min，37%～50%A；20～35 min，50%～80%A；35～40 min，80%～100%A；40～50 min，100%A；50～70min，37%A。流動相流速0.7mL/min；柱溫35℃；檢測波長283nm；進樣量5μL。

1.3.6 數據處理

單因素及正交試驗數據用統計軟件SPSS 20.0進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 桂圓酵素發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 菌種組合

發酵菌株組合對桂圓酵素總酚含量的影響如圖1所示。由圖1可知，組合①、④、⑦與組合②差異顯著（P＜0.05），說明菌株組合對桂圓酵素的總酚含量有顯著影響。因此，選取組合①、④、⑦進行桂圓酵素發酵正交試驗。

圖1 發酵菌株組合對桂圓酵素總酚含量的影響Fig.1 Effect of fermentation strains combination on total phenoliccontent of longan ferment

2.1.2 發酵溫度

發酵溫度對總酚含量的影響結果如圖2所示。由圖2可知，在28～38℃范圍內，桂圓酵素中總酚含量隨發酵溫度的升高，呈先增加后降低的趨勢。在發酵溫度38℃時總酚含量最低，與最小值（38℃）比較，28℃、30℃、32℃及34℃時的4個溫度水平均差異顯著（P＜0.05），說明發酵溫度對桂圓酵素的總酚含量有顯著影響。選取其中總酚含量高的28℃、30℃、32℃三個溫度水平，進行桂圓酵素發酵條件優化正交試驗。

2.1.3 發酵時間

圖2 發酵溫度對桂圓酵素總酚含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on total phenolic content oflongan ferment

發酵時間對總酚含量影響的結果如圖3所示。由圖3可知，在12～72 h范圍內，桂圓酵素中總酚含量隨發酵時間的升高，呈先增加后降低的趨勢。發酵時間為12 h時總酚含量最低，與最小值（12 h）比較，其他5個時間水平均有顯著差異（P＜0.05），說明發酵時間對桂圓酵素的總酚含量有顯著影響。選取其中總酚含量高的24 h、36 h、48 h三個發酵時間水平，進行桂圓酵素發酵條件優化正交試驗。

圖3 發酵時間對桂圓酵素總酚含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total phenolic content oflongan ferment

2.2 桂圓酵素發酵工藝優化正交試驗

依據單因素試驗結果，選取菌株組合（A）、發酵溫度（B）及發酵時間（C），進行3因素3水平（L9（33））正交試驗，優化桂圓酵素的發酵工藝，結果與分析如表1所示。2.3 HPLC分析桂圓酵素的酚類化合物

表1 桂圓酵素發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for longan ferment fermentation conditions optimization

利用正交試驗確定的最優工藝進行桂圓酵素發酵，發酵后對桂圓水提液和桂圓酵素進行高效液相色譜分析，結果見圖4。

圖4 混合標準品（A）、桂圓水提液（B）及酵素（C）中多酚類化合物的HPLC圖Fig.4 HPLC chromatogram of phenolic compounds in mixed standards(A),water extract(B)and longan ferment(C)

菌株組合、發酵溫度及發酵時間這3個因素所對應的極差（R）為RC＞RB＞RA，從而得知影響桂圓酵素發酵的主次因素依次為發酵時間＞發酵溫度＞菌株組合。由極差分析可知，桂圓酵素發酵工藝的最優方案為A3B2C2。即發酵菌株組合為⑦（釀酒酵母+醋酸桿菌+植物乳酸桿菌）、發酵溫度為30℃、發酵時間為36h。在此條件下進行3次驗證試驗，結果表明，桂圓酵素的總酚含量達（46.05±0.76）μg/mL，是桂圓水提液總酚含量（9.12±0.26）μg/mL的5.05倍。此條件下生產的酵素營養、功能及衛生指標符合要求。

由圖4可知，與桂圓水提液（圖4B）比較，桂圓酵素（圖4C）酚類化合物的總含量與種類均明顯增加。在桂圓水提液中檢測到的酚類化合物至少有10種，其中含量較高的保留時間集中在3～8 min（圖4B）；含量較低的酚類化合物保留時間集中在8 min后，至少有11種；參照標準品（圖4A）可以確定其中1種為綠原酸（圖4B中峰1）。桂圓酵素中至少含有20余種酚類化合物，含量較高的保留時間集中在3～11min及16～21 min；參照標準品（圖4A）可以確定其中2種為綠原酸及柚皮苷（圖4C中的峰1，峰3）。

進一步比較桂圓水提液（圖4B）與桂圓酵素（圖4C）的HPLC圖譜發現，峰B1與峰C2、峰B2與峰C3、峰B8與峰C15、峰B9與峰C17的保留時間分別一致，所以它們應分別為同一種酚類物質。因此除此上述4種酚類化合物及綠原酸之外，桂圓水提液中所檢測到的其他酚類化合物，經發酵后均被完全轉化。桂圓酵素（圖4C）中至少有16個峰的保留時間與桂圓水提液不一致，說明桂圓酵素中至少有16種酚類化合物為新生成；對新生成16酚類化合物與5種標準品的保留時間進行比較，可以確定其中1種為柚皮苷（圖4C中峰3）；對應于標準品按峰面積進行計算，桂圓酵素中柚皮苷含量為3.32 μg/mL。桂圓水提液中某些酚類化合物的完全被轉化，及桂圓酵素中新生成了桂圓水提液中原來沒有的酚類化合物，是釀酒酵母、醋酸桿菌與植物乳酸桿菌協同催化的結果，將在后續研究中進一步研究其協同催化機制與催化效率。

3 結論

以總酚含量為評價指標，優化后的桂圓酵素發酵工藝為：發酵菌株組合釀酒酵母＋醋酸桿菌＋植物乳酸桿菌（1∶1∶1）、接種量10%、發酵溫度30℃、發酵時間36 h。在此工藝條件下，桂圓酵素的總酚含量達（46.05±0.76）μg/mL，是桂圓水提液總酚含量（9.12±0.26）μg/mL的5.05倍。原桂圓水提液中檢測到的10多種酚類化合物，在最優工藝條件下，除了綠原酸及其他4種酚類化合物外，其余酚類化合物經發酵后均被完全轉化。最優工藝條件下制得的桂圓酵素中至少含有20余種酚類化合物，至少有16種為新生成；新生成的酚類化合物中的1種可以確定為柚皮苷，其在桂圓酵素中含量達3.32 μg/mL。