黃曲霉毒素B1降解菌株的篩選及鑒定

金佳佳，吳思敏，鄭思珩，張 娟，嚴家俊*

（1.廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東 佛山 528300；

2.黃埔海關技術中心，廣東 廣州 510730）

黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是目前已發現的黃曲霉毒素中毒性最強的一種，其具有強肝毒性、高致突變性和高致畸性[1]，廣泛存在于農產品及飼料食品中，對人類健康存在嚴重威脅，同時對糧食和畜牧業造成嚴重的經濟損失。AFB1的去除方法主要有物理法、化學法和微生物法。相對于物理法和化學法而言，微生物降解法反應條件溫和，不易造成營養的流失，也不易產生新的毒素[2-3]。有選擇性的使用微生物降解AFB1是一種對產品價值無明顯損壞的去毒方法，因而，尋找能夠高效安全降解AFB1的菌株已成為目前的研究熱點[4-5]。

近年來，國內外已對降解AFB1的微生物進行了大量研究。PETCHKONGKAEWA等[6]從泰國傳統發酵豆制品中篩選到一株能降解AFB1的芽孢桿菌（Bacillusspp.）；TENIOLAO等[7]從受多環芳烴污染的土壤中分離出一株具有降解AFB1的紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis）；張盼等[8]從發酵食品納豆中篩選出一株AFB1降解率達到85.73%的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；關心等[9]從雞糞中分離得到一株對AFB1高效降解的蔬菜芽孢桿菌（Bacillus oleronius）；朱新貴等[10-12]也利用該種方法篩選得到不同的菌株。

雖然已有大量研究，但是真菌對AFB1降解率不高，且降解機理較為復雜，反應時間較長，因而較難進行實際應用[13-14]。細菌降解AFB1是一種有效、安全和環保的解毒方法。因此，本實驗從多種不同環境中篩選能夠高效、安全降解AFB1的細菌，并采用形態觀察、生理生化實驗及分子生物學技術對菌株進行鑒定。一方面為生物法降解AFB1的研究奠定基礎，另一方面通過初步研究，為后期生物法降解AFB1的實際應用提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

豆類發酵食品、不同環境的土壤、動物腸道及其內容物：采集于佛山地區。

1.1.2 主要試劑

香豆素、AFB1標準品：美國Sigma公司；真菌抑制劑：美國Biosharp公司；AFB1快速檢測試劑盒：北京華安麥科生物技術有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DNAMarker、DNA膠回收盒：日本Takara公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國默克公司；革蘭氏染色液試劑盒：青島海博生物技術有限公司；考馬斯亮藍快速染色液：北京百奧萊博科技有限公司。

1.1.3 培養基

富集培養基：（NH4）2SO45.0g，NaCl8.5g，超純水1000mL，pH 7.0，121℃滅菌15 min。加入過濾除菌的香豆素溶液至1 g/L。

初篩培養基：（NH4）2SO45.0 g，KH2PO42.5 g，MgSO41.0 g，Na2HPO4·12H2O 0.5 g，CaCl20.1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 6.5，121℃滅菌15 min。加入過濾除菌的香豆素溶液至1 g/L。

營養肉湯培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，NaCl 5.0 g，pH 7.0，121℃滅菌15 min。固體培養基中加入20 g瓊脂。

復篩培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，葡萄糖1.0 g，NaCl8.5g，KH2PO41.0g，蒸餾水1L，pH6.0，121℃滅菌15min。

斜面培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

Multiskan MK3酶標儀：美國Thermo公司；MS3旋渦混合器：德國IKA公司；AG22331聚合酶鏈式反應（polymerase chainreaction，PCR）儀：德國艾本德公司；DYCZ-24電泳儀：北京六一生物科技有限公司；BX51顯微鏡：日本奧林巴斯公司；GHP-9160隔水式培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；CL-40M高壓滅菌鍋：日本ALP公司。

1.3 方法

1.3.1 富集培養

取5 g樣品于含有45 mL生理鹽水的均質袋中，利用均質器使樣品和生理鹽水混合均勻。從中吸取5mL加入45mL富集培養基中，加入0.1 g真菌抑制劑，37℃、150 r/min振蕩培養24h，進行富集培養，以相同培養條件連續富集3次。

1.3.2 AFB1降解菌株的篩選

初篩：取富集培養液1mL于含9mL生理鹽水的試管中，渦旋混勻。梯度稀釋至10-4，吸取200 μL稀釋液涂布于初篩培養基上，37℃倒置培養7 d。選取生長良好的單菌落保存于斜面培養基。

復篩：取斜面培養基中的菌株一環接種于10 mL營養肉湯培養基中，37℃、150 r/min振蕩培養24 h。取5 mL營養肉湯培養液于45 mL復篩培養基中，37℃、150 r/min振蕩培養3d。取培養液800μL，加入200μL質量濃度為100μg/L的AFB1標準品，以復篩培養基加等量AFB1標準品作為空白對照組。將樣品置于37℃條件下避光靜置培養72h后，4000r/min離心5min，吸取上清液，采用酶聯免疫試劑盒測定AFB1含量。

1.3.3 降解作用與吸附作用的區分

將1.3.2中與AFB1反應后的培養液進行離心，去除上清液。加入1.0 mL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（10 mmol/L，pH 7.0），渦旋混勻。37 ℃靜置10 min，離心，將洗脫液移至5 mL離心管中，重復洗脫3次。使用體積分數為60%的甲醇進行提取，采用酶聯免疫試劑盒測定提取液中AFB1的含量。以含質量濃度為20 μg/L AFB1的磷酸鹽緩沖液作為空白對照。

1.3.4 AFB1降解菌株的鑒定

形態學鑒定：將篩選菌株接種于營養肉湯培養基中，37℃條件下培養24h。采用接種環在營養瓊脂平板上劃線，37℃條件下培養48 h，觀察菌落形態，并進行革蘭氏染色，觀察細胞形態。

生理生化鑒定：分別進行過氧化氫酶、接觸酶、脲酶、氨基酸脫羧酶與水解酶、糖醇類發酵、硝酸鹽還原、酸堿耐受性等試驗，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[15]和《伯杰氏系統細菌學手冊》[16]進行初步鑒定。

分子生物學鑒定：采用DNA提取試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對篩選菌株的16SrRNA進行PCR擴增。PCR擴增體系：模板DNA2μL，上下游引物（20μmol/L）各1 μL，PremixTaqDNA聚合酶25 μL，雙蒸水（ddH2O）21 μL。PCR擴增條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個循環；72℃再延伸10 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠檢測后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行Blast同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA序列，采用MEGA 7的鄰接（neighbour-joining，NJ）法構建系統發生樹。

2 結果與分析

2.1 AFB1降解菌株的初篩結果

AFB1是香豆素的衍生物，兩者結構相似。AFB1具有很強的毒性，如果使用AFB1直接進行初篩實驗，可能會危害實驗者的身體健康。LEELS等[17]研究發現，微生物降解AFB1的過程可能是分解AFB1中的香豆素基團，從而導致其毒性、致畸性的降低。

因此，本研究以香豆素代替AFB1為唯一碳源，進行初篩，結果見表1。由表1可知，共有9株細菌在以香豆素為唯一碳源的培養基中生長良好，其中2株（FJ4、FJ12）來源于發酵食品，1株（HS1）來源于花生地土壤、6株（ZC2、YAC2、JF1、YF4、YC2、YC8）來源于動物腸道及其內容物。

表1 黃曲霉毒素B1降解菌株初篩結果Table 1 Preliminary screening results of aflatoxin B1degrading strains

2.2 AFB1降解菌的復篩結果

對初篩得到的9株細菌進行復篩，結果見圖1。由圖1可知，空白對照組中，AFB1降解率為2.2%，9株細菌的AFB1降解率均高于空白對照組，且8株細菌的AFB1降解率均＞50%，其中菌株YC2的AFB1降解能力最強，降解率達到90.7%。因此，選擇菌株YC2進行進一步研究。

圖1 黃曲霉毒素B1降解菌株復篩結果Fig.1 Secondary screening results of aflatoxin B1degrading strains

2.3 降解作用與吸附作用的區分

微生物去除AFB1主要有兩種作用方式，一種是降解作用，即將AFB1分解轉化，形成新的低毒或無毒的產物。另一種是吸附作用。吸附作用是一種可逆的過程，主要是通過菌株細胞壁吸附黃曲霉毒素，而非共價結合，這種作用過程雖能有效降低AFB1，然而隨著時間的延長，毒素會重新釋放，是一種可逆的過程，無法對毒素達到有效的去除。因此，區分菌株降解和吸附作用是研究細菌降解AFB1的關鍵[18-22]。

菌株YC2的培養液與AFB1反應后，進行洗脫、萃取，測定萃取液中AFB1的含量，空白對照中AFB1的提取率達到96.3%，而菌株YC2與AFB1反應后的萃取液中AFB1提取率只有2.2%。結果表明，菌株YC2對AFB1的去除過程主要為降解反應，不是吸附作用。

2.4 菌株YC2的鑒定

2.4.1 菌株的形態學鑒定

菌株YC2的菌落和細胞形態見圖2。由圖2a可知，菌株YC2在營養瓊脂平板上的菌落呈圓形、乳白色，邊緣整齊且薄，菌體中央微隆起，呈丘狀。由圖2b可知，細胞形態呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性。

圖2 菌株YC2的菌落（a）和細胞（b）形態Fig.2 Colony(a)and cell(b)morphology of strain YC2

2.4.2 菌株的生理生化特征

由表2可知，菌株YC2能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇等；水解淀粉、液化明膠、還原硝酸鹽、檸檬酸鹽、7%NaCl、甲基紅試驗、過氧化氫酶試驗等均呈陽性反應；吲哚、硫化氫、苯丙氨酸酶試驗等均呈陰性，且不耐受10%NaCl。參照《常見細菌系統鑒定手冊》[15]和《伯杰氏系統細菌學手冊》[16]，并結合形態特征，初步鑒定菌株YC2隸屬于芽胞桿菌屬（Bacillus）。

表2 菌株YC2的生理生化試驗結果Table 2 Physiological and biochemical tests results of strain YC2

2.4.3菌株的分子生物學鑒定結果

菌株16SrRNA的PCR擴增結果見圖3。由圖3可知，PCR擴增產物的堿基長度約1 500 bp，與預期結果相符。

圖3 菌株YC2 16S rRNA PCR擴增產物電泳圖Fig.3 Electrophoregram of 16S rRNA PCR amplification products of strain YC2

PCR擴增產物經測序，將測序結果提交至NCBI的GenBank數據中進行Blast比對發現，該菌株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性最高，達99%。選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA序列，采用MEGA 7軟件中的NJ法構建系統發育樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株YC2與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）KCTC 13241聚于一支，親緣關系最近，因此，鑒定菌株YC2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖4 基于16S rRNA序列菌株YC2的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain YC2 based on 16S rRNA sequences

3 結論

以香豆素為唯一碳源，從豆類發酵食品、土壤、動物腸道及其內容物中篩選到9株具有AFB1降解能力的菌株，通過復篩，篩選到一株AFB1降解能力最高的菌株YC2，AFB1降解率為90.7%。通過降解作用與吸附作用的區分，確定該菌株去除AFB1主要為降解作用。通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術鑒定菌株YC2為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。本研究為生物法降解AFB1的研究奠定基礎，同時，為后期生物法降解AFB1的實際應用提供技術依據。