土壤來源抗MRSA放線菌的篩選及次級代謝潛力評估

梁大敏，田 鵬，劉 鐵，吳德靜，岳昌武，3*

（1.遵義醫藥高等專科學校，貴州 遵義 563003；

2.遵義市第一人民醫院/遵義醫科大學第三附屬醫院中心實驗室遵義市基因遺傳病精準診斷及藥物靶向治療重點實驗室，貴州 遵義 563003；

3.延安大學 醫學院，陜西 延安 716000）

多藥耐藥病原菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）、耐青霉素肺炎鏈球菌（penicillin-resistantStreptococcus pneumoniae，PRSP）、耐多藥結核分枝桿菌（multiple drugs resistant tuberculosis，MDR-TB）等革蘭氏陽性菌和耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii，CRAB）、超廣譜β-內酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBL）腸桿菌等革蘭氏陰性菌[1-2]，其介導的感染性疾病是當今世界需要亟待解決的健康安全問題。現有的抗生素對MRSA介導的感染性疾病治療效果降低或者無效，導致患者死亡率增加，已超過艾滋病和肺結核患者[3-4]，美國每年大約有23 000名患者死于MRSA引起的感染[5-6]。因此，針對MRSA開發新的抗生素顯得極其重要。

放線菌（actinomycete）是一種能產大量活性次級代謝產物的絲狀細菌，臨床上2/3的抗生素主要來源于放線菌。已有文獻報道[7]，放線菌代謝產物中具有生物活性的物質約12000種，其中具有抗生素活性的代謝產物多達10000種，是新型抗生素開發的寶貴資源庫。目前，基因篩選的方法已被較多應用于放線菌新的活性次級代謝產物的研究，且基本都是基于聚酮合酶I型（polyketide synthase I，PKS I）、聚酮合酶II型（polyketide synthase II，PKS II）、非核糖體多肽合成酶（nonribosomalpeptidesynthetase，NRPS）和后修飾酶[如鹵化酶（halogenase，Hal）]進行的基因篩選[8-9]。LI X G等[10]使用還原黃素腺嘌呤二核苷酸（reduced flavine adenine dinucleotide，FADH2）依賴型鹵化酶基因篩選的方法，從163株紅樹林放線菌中篩選出26株具有抑菌或抑制腫瘤活性的陽性菌株，證明了鹵化酶基因篩選的有效性；LU Y等[11-12]從貴州梵凈山等地篩選出Hal、NRPS、PKS I陽性鏈霉菌（Streptomycessp.）FJS31-2，且從中分離出具有抗MRSA、抗肝癌的新化合物zunyimycin A、B、C；楊小燕等[13]利用靶向PKS II的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術從167株海洋放線菌中發現12株PKS II陽性菌株，且從陽性菌株Streptomycessp.PKU-MA00218中發現新的聚酮類天然產物angucyclinone C。

貴州省黔北地區保留了其獨特的原生態環境，這些原生態環境中可能蘊藏極為豐富而獨特的微生物資源，具有從中開發微生物抗菌藥物的巨大潛力，值得進一步研究[9]。因此，本研究以抗MRSA活性為導向，同時基于NRPS、PKSI、PKS II 3種產物骨架合成基因和Hal修飾關鍵酶基因勘探，對來自黔北地區土壤放線菌進行分離篩選，以期找到具有較好抗MRSA活性的放線菌菌株，為獲得可能創制抗MRSA新藥的苗頭藥或先導化合物提供菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

土樣：32份試驗土樣采集于貴州遵義鳳凰山公園（10份）、赤水丹霞山（12份）、大板水國家森林公園（10份）周邊人員活動較少地區、海拔500～1 000 m左右的除地表腐殖質10～20cm的土層，分裝于無菌樣品采集袋中常溫保存運輸。

1.1.2 菌株

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）31：由本實驗室保藏。

1.1.3 培養基

改良高氏1號培養基：可溶性淀粉20g，NaCl0.5g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，玉米汁50 mL，土壤浸出物[14]50 mL，土壤樣品細粉10 g，復合維生素浸提物10 mL，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH 7.2，115℃高壓滅菌30 min。其中玉米汁的制備：稱取新鮮的玉米100 g，加入1 L蒸餾水，用豆漿機攪拌均勻后，濾掉廢渣，補加蒸餾水至2 L，經微孔濾膜過濾除菌后于4℃冰箱保存備用；復合維生素浸提物的制備：取21金維他多維元素片20片（0.825 g/片）研磨成粉，入15 mL無水乙醇和35 mL無菌水振蕩懸浮，8 000 r/min離心10 min，上清用微孔濾膜過濾除菌后于4℃冰箱保存備用。

土壤浸汁腐殖酸培養基[14]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，微量元素預混液（ZnSO4·7H2O 2 g/L，FeSO4·7H2O 2 g/L，MnCl2·4H2O 2g/L，CuSO4·5H2O 2 g/L，Na2B4O7·10H2O 2 g/L，（NH4）6Mo7O24·4H2O 2 g/L）0.5 mL，腐殖酸2.0 g，瓊脂18 g，土壤浸出物1 L，pH 7.2，121℃高壓滅菌30 min。

國際鏈霉菌計劃（internationalStreptomycesproject，ISP）2培養基[15]：葡萄糖4 g，CaCO32 g，麥芽抽提物10 g，酵母抽提物4 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 L，115℃高壓滅菌30 min。

改良的葡萄糖酵母麥芽（glucose yeast malt，GYM）鏈霉素培養基[16]：葡萄糖4 g，CaCO32 g，麥芽抽提物10 g，酵母抽提物4g，微量元素預混液0.5mL，腐殖酸浸出液10mL，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L，115℃高壓滅菌30 min。

GYM液體培養基：葡萄糖4 g，酵母提取物4 g，麥芽提取物10 g，蒸餾水定容至1 L，115℃高壓滅菌30 min。

LB液體培養基[16]：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 L，121℃高壓滅菌30 min。LB固體培養基：在LB液體培養基中加入瓊脂20 g。

1.1.4 主要試劑

抗生素、抗菌藥物儲存液（重鉻酸鉀50 mg/L，制霉菌素20 mg/L，萘啶酮酸20 mg/L，放線菌酮50 mg/L）：德國Sigma公司；酚、氯仿等脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑：北京索萊寶科技有限公司；乙酸乙酯、甲醇（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；ExTaq酶（5U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mixture、TaqBuffer等分子生物學試劑及酶類：寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

BSP-400培養箱：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；E002092超級潔凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；Direct-Q5UV超純水機：美國密理博公司；MLS-3781L-PC自動蒸汽滅菌器：日本松下公司；T100快速梯度PCR儀：美國伯樂公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統：美國伯樂公司；DYCP-33A電泳儀：北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

土壤樣品預處理：每份樣品分別稱2 g于無菌研缽中，加入0.2 g CaCO3，用無菌杵研磨成細粉，裝入50 mL無菌離心管中，28℃風干2周后，加入30 mL無菌水，置于28℃搖床上150 r/min振蕩1 h使土壤充分懸浮，55℃處理20 min，促使放線菌孢子萌發[14]。

菌株的分離純化：采用梯度稀釋法將土壤預混液分別稀釋成10-2、10-3和10-43個濃度梯度，振蕩混勻，分別吸取不同濃度梯度的土樣懸濁液200 μL均勻涂布于4種放線菌分離培養基（改良高氏1號培養基、土壤浸汁腐殖酸培養基、ISP2培養基、改良的GYM鏈霉素培養基）上，28℃靜置培養，隨時觀察培養基上的菌落生長狀態，挑取目的菌株進行分離純化并保藏。

1.3.2 抗MRSA活性的測定

將MRSA接種于100 mL LB液體培養基中，37℃、200 r/min條件下振蕩培養6～8 h，取10 mL菌液與200 mL未凝固的LB培養基混合均勻后倒板。用無菌打孔器挖取直徑6 mm的分離菌株于含有MRSA的LB固體培養基上，于37℃培養箱中過夜培養，觀察抑菌圈的有無。

1.3.3 菌株的分子生物學鑒定

參照文獻[17]提取活性菌株的基因組總DNA，以其為模板，利用細菌16S rRNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR擴增體系：EXTaq酶0.25μL，10×buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）4 μL，MgCl24μL，模板DNA2μL，27F1μL，1492R1μL，雙蒸水（ddH2O）32.75μL。PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30s，72℃延伸90s，共30個循環；72℃再延伸5min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，PCR擴增產物送至上海英駿生物公司完成。測序結果在美國國立生物技術信息中心（nationalcenter for biotechnology information，NCBI）的Genbank數據庫中進行Blast同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA序列，采用Mega 6.0軟件中的鄰接（neighbour joining，NJ）法構建系統進化樹[18-19]。

1.3.4 功能基因的勘探

以提取的基因組DNA為模板，利用Hal、PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS基因的保守引物（見表1）分別進行PCR擴增。根據不同的引物和擴增片段選擇相應的PCR擴增體系[13，20-22]，PCR擴增條件[22]：94℃預變性5min；94℃變性30s，56℃退火30 s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃再延伸5 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

表1 本研究所采用的引物、序列及用途Table 1 Primers and its sequences and application used in the study

2 結果與分析

2.1 菌株分離純化及抗MRSA分析

從采集的32份土樣中共分離到169株放線菌菌株，其中赤水丹霞山土樣65株（以CS命名菌株）、鳳凰山公園土樣45株（以FHS命名菌株）、大板水國家森林公園土樣59株（以DBS命名菌株）。采用瓊脂擴散法對分離菌株的抗MRSA活性進行測定，部分分離菌株的抗MRSA活性結果見圖1。

圖1 部分分離菌株抗MRSA活性測定結果Fig.1 Determination results of anti-MRSA activity of partiallyisolated strains

由圖1可知，不同分離菌株具有不同程度的抗MRSA活性，且分離的169株菌株中有68株具有抗MRSA活性，占總分離菌株的40.24%。因此，以68株活性抗MRSA菌株進行后續的基因組勘探。

2.2 活性菌株的分子生物學鑒定

選取68株活性菌株，利用細菌16S rRNA通用引物27F/1492R進行PCR擴增，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠檢測，部分結果見圖2。由圖2可知，PCR擴增產物的堿基長度約1 500 bp，與預期結果相符，PCR擴增產物進行測序。

圖2 活性菌株16S rRNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA PCR amplification products of active strains

將68株活性菌株的16S rRNA PCR擴增產物測序結果提交至NCBI進行Blast同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA基因序列，利用Mega 6.0軟件中的NJ法構建系統進化樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株FHS2-3為諾卡氏菌屬（Nocardiasp.），其他分離菌主要為鏈霉菌屬（Streptomycessp.），這與程少軍等[23]的研究結果一致，說明在貴州喀斯特土壤環境中鏈霉菌屬在放線菌中是優勢菌屬。

圖3 基于16S rRNA序列68株活性菌株的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 68 active strains based on 16S rRNA sequences

同時Blast比對中，菌株DBS8-4、DBS8-13、CSGY1-11、CSHG2-5、CSDG1-2、CSDG5-5、CSGY1-3、CSGY5-3、CSGY 1-9、FHS4-7與NCBI的GenBank數據庫中已有菌株的16SrRNA序列相似性＜98%，說明本地區土壤放線菌中可能蘊藏潛在的較新穎菌株，具有開發的潛力。

2.3 次級代謝潛力基因勘探

CHRISTIANSEN G等[24]指出鹵化酶基因、聚酮合酶基因、非核糖體肽基因等可以作為指示基因對微生物產次級代謝產物的潛力進行快速評估。利用微生物的基因組信息預測其合成特定天然產物的潛能，進而進行新化合物分離純化和結構鑒定的基因組挖掘技術。

因此，本研究對具有抗MRSA活性的68株活性菌株的次級代謝產物生物合成過程中的修飾酶基因鹵化酶（Hal）及催化主骨架合成的非核糖體肽合成酶（NRPS）、I型聚酮合酶（PKS I）、II型聚酮合酶（PKS II）基因進行PCR擴增，結果見表2。由表2可知，68株活性菌株中，Hal基因陽性的菌株12株，占活性菌株的17.65%，PKS I基因陽性菌株18株，占活性菌株的36.47%，PKS II基因陽性的菌株42株，占活性菌株的61.77%，NRPS基因陽性的菌株22株，占活性菌株的32.35%。說明黔北地區放線菌基因組中存在多種化合物骨架合成酶及后修飾酶相關基因，提示可能含有骨架多樣結構新穎的天然產物，應進一步深入挖掘。

表2 68株活性菌株的次級代謝產物基因勘探Table 2 Secondary metabolic product gene exploration of 68 active strains

續表

注：“+”表示結果呈陽性，具有該基因；“-”表示結果呈陰性，無該基因。

3 結論

本研究從32份土樣中共分離純化到169株放線菌，其中68株菌株具有抗MRSA活性，占總分離菌株的40.24%。通過16S rRNA序列分析可知，68株活性菌株主要為鏈霉菌屬（Streptomycessp.），其中菌株DBS8-4、DBS8-13、CSGY1-11、CSHG2-5、CSDG1-2、CSDG5-5、CSGY1-3、CSGY5-3、CSGY 1-9、FHS4-7與NCBI的Genbank數據庫中已有菌株的16S rRNA序列相似性＜98%，說明本地區土壤放線菌中可能蘊藏潛在的較新穎菌株，具有開發的潛力。

通過對68株活性菌株的次級代謝產物基因的勘探可知，Hal陽性菌株占17.65%，PKSI陽性菌株占36.47%，PKSII陽性菌株占61.77%，NRPS陽性菌株占32.35%，其中菌株DBS9-1、DBS12-6、DBS8-13、DBS22-6、CSDG1-2、FHS5-10、FHS10-22中同時含有NRPS或Hal、PKSI、PKSII三種基因，本實驗可為后續通過激活特定合成的基因組定向挖掘該類化合物等研究提供參考。