酒曲中酵母菌的分離鑒定及果酒發酵的初步研究

杜剛，陸小凱，詹夢濤，婁水珠，陳靜，楊海英，

（1.云南民族大學民族藥資源化學國家民族事務委員會-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500；2.云南民族大學化學與環境學院，云南 昆明 650500）

果酒是采用新鮮的果實或果汁作為原材料，通過搗碎、發酵、壓榨以及浸泡等方式釀制而成的飲料酒[1]。因果酒中含有大量的糖、多酚、有機酸、酯類、多種維生素及人類所需的氨基酸等物質，營養豐富，適量飲用有益身心健康[2-3]。近年來酒類消費倡導以果酒取代糧食酒，各種果酒的研究引起了廣泛關注[4-7]。果酒釀造中分離和篩選出適合果酒發酵的菌株是決定果酒質量及風味的關鍵因素，要保證高效生產并且提高生產效率，就要篩選出優良的生產菌種進行純種發酵[8-11]。

酵母菌是果酒生產中的主要微生物，釀酒酵母普遍應用于釀制白酒、紅酒、啤酒和果汁飲料的生產，其生物合成過程中會形成多種多樣的代謝產物，從而對食品風味產生重要影響[12-14]。本試驗從市售酒曲樣品中分離出酵母菌，通過26S rDNA 序列分析進行了菌種鑒定，經過感官評價初篩獲得性能較優的酵母，采用頂空固相微萃取-氣質聯用技術（solid phase microextraction -gas chromatography/mass spectrometry ，SPME-GC/MS）方法[15-17]對篩選出的酵母菌株在獼猴桃汁培養基中的產香進行研究，為篩選用于果酒生產的酵母菌株提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

試驗所用酒曲為市售酒曲，樣品1：廣西都安縣傳統白酒酒曲；樣品2：廣西河池壯家米香型酒曲；樣品3：浙江金華醬香酒曲；樣品4：福建古田紅曲；樣品5：貴州銅仁玉屏燒酒曲；樣品6：湖北黃石清香型酒曲。

1.1.2 培養基配制方法

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養基（1L）：葡萄糖 20 g，蛋白胨20 g，瓊脂 20 g，酵母膏 10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 自然，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

YPD 液體培養基（1 L）：葡萄糖 20 g，蛋白胨 20 g，酵母膏 10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 自然，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基（potato dextrose agar，PDA）（1 L）：葡萄糖 20 g，馬鈴薯 200 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 mL，分裝錐形瓶，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2PD 潔凈操作臺：蘇凈安泰空氣技術有限公司；ZHWT-2012 恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250-G 恒溫干燥培養箱：廣東省醫療器械廠；YXQ-LS-100SII 立式壓力蒸汽滅菌器鍋：上海博迅實業有限公司；THERMOFISHER（ISQ）氣相色譜/質譜聯用儀、TR-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）毛細管色譜柱：美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；手動固相微萃取裝置、100μm 聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxcane，PDMS）固相微萃取頭：安捷倫科技有限公司；恒溫加熱磁力攪拌器：德國IKA公司；Scout SE 電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離純化

取1 g 酒曲樣品，放入裝有100 mL 無菌蒸餾水的錐形瓶中，恒溫搖床振蕩10 min 將樣品充分打散、混勻，用雙層的無菌紗布過濾，樣品稀釋至10-2～10-7。分別將上述6 個濃度的稀釋液用移液槍移取0.2 mL 于不同的PDA 固體培養基上，每個梯度做3 個平行并分別做好標記。靜置1 min 于28 ℃恒溫培養箱倒置培養48 h 后觀察并記錄。挑取具有典型酵母菌形態特征的菌落，鏡檢為純種后，進行劃線分離，直至得到單菌落。挑取單菌落轉接到YPD 斜面上，標明日期及編號放于28 ℃恒溫培養箱培養，待其長出來后裝入密封袋置于4 ℃冰箱保藏。

1.3.2 酵母菌的鑒定

1.3.2.1 菌種的形態特征觀察

挑取少量菌種于PDA 平板上劃線純化，28 ℃培養2 d，選取單個菌落制成裝片用光學顯微鏡高倍下觀察其大小、干濕、隆起、顏色、邊緣情況、表面光澤、菌落質地等細胞形態。

1.3.2.2 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增和 DNA 測序

斜面菌種活化后，酵母菌接種于150 mL YPD 液體培養基，27 ℃培養 3 d～4 d，培養物 13 000 r/min 離心6 min，收集菌體，液氮凍融-十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）提取 DNA。26S rDNA D2 PCR擴增引物NL1：5′ -GCATATCAATAAGCG GAGGAAAAG -3′ 和 NL4：5′ -GGTC CGTGTTTCAAG-3′。PCR 反應體系為：Taq MIX 25 μL，Bestaq MasterMix/with dye（25 μL），引物各 2.5 μL，模板5 μL，加無酶水補足 50 μL。程序為：95 ℃預熱 3 min，95 ℃變性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，72 ℃終延伸 5 min，30 個循環后 72 ℃末端延伸 10 min，4 ℃保存。PCR 產物以瓊脂糖電泳檢測，測序由昆明碩擎生物科技有限公司完成。

1.3.2.3 26S rDNA 基因序列測定及系統發育樹分析

酵母菌分析所得DNA 序列用DNAMAN 生物軟件進行拼接，用MEGA6.0 進行酵母序列的同源性比對（Alignment）和利用鄰接（neighbour-joining，NJ）法系統發育樹構建[18]。

1.3.3 酵母菌的篩選

將“1.3.1”分離得到的菌株分別接種到YPD 培養基中，28 ℃培養 3 d～5 d 以后，通過感官分析[19]篩選出具有果香和略帶花香氣味的菌株，將初篩獲得的酵母菌接種到獼猴桃汁液體培養基中，28 ℃培養3 d～5 d，再通過感官分析篩選出具有比較濃郁的酒香味或獨特果香味的菌株。

1.3.4 酵母菌的發酵產香研究

獼猴桃干果與水按1 ∶9 的質量比混合，浸泡30 min，攪拌機打碎得到獼猴桃汁培養基。將1.3.3 篩選得到的酵母菌接種到獼猴桃汁培養基中活化24 h后，以5.0%接種量接種于裝有200 mL 獼猴桃汁的三角瓶中，發酵溫度為28 ℃，發酵時間10 d。發酵液過濾后得到獼猴桃汁發酵樣品。

1.3.5 揮發性成分分析

1.3.5.1 揮發性成分的提取

利用手動頂空固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）法對獼猴桃汁發酵樣品中揮發性物質進行富集，取發酵樣品5 mL 于樣品瓶中，加入0.5 g NaCl，將老化好的萃取頭插入到樣品瓶頂空部分，在45 ℃的恒溫磁力攪拌器上，轉速為180 r/min 條件下萃取 30 min，GC 進樣口（溫度 240 ℃）解吸附 1 min，用于氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析。

1.3.5.2 氣相色譜質譜工作條件

色譜條件為TR-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度 240 ℃；載氣為氦氣；柱流量為1 mL/min；進樣模式：分流模式（分流比為 10 ∶1）。

程序升溫：起始溫度為 30 ℃，保持 2 min，以5 ℃/min 的速率升至 80 ℃保持 1 min，以 10 ℃/min 的速率升溫至100 ℃保持1 min，以20 ℃/min 的速率升溫至230 ℃保持1 min。

質譜條件：EI 離子源，電子能量為70 eV，倍增器電壓1 600 V。質譜掃描范圍為10 a.m.u ～500 a.m.u，掃描方式：全掃描，掃描速度：0.2 scan/s。離子源溫度：255 ℃，傳輸線溫度：265 ℃。

各組分通過Nist11 譜庫檢索進行定性分析，運用面積百分比法計算相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離和初篩結果

從6 種酒曲中共分離出10 株酵母菌，其中從樣品1 分離出2 株，編號CK01、CK02；從樣品2 分離出2株，編號CK03、CK04；從樣品3 分離出1 株，編號CK05；從樣品 4 分離出 2 株，編號 CK06、CK07；從樣品5 分離出 1 株，編號 CK08；從樣品 6 分離出 2 株，編號CK09、CK10。

通過感官分析初步篩選出酒香型酵母菌2 株（CK03、CK10），濃香型酵母菌5株（CK01、CK02、CK04、CK05、CK07），清香型酵母菌 3 株（CK06、CK08、CK09）。

2.2 酵母菌株的形態鑒定結果

對分離得到的10 株菌株在顯微鏡下進行形態特征觀察，觀察結果見表1。

表1 酵母菌菌落形態觀察結果Table 1 The table of yeasts colony morphology

2.3 菌株的分子鑒定

2.3.1 酵母菌株的PCR 結果

10 株酵母菌株PCR 擴增產物片段大小在500 bp～750 bp 之間，如圖1所示。

圖1 10 株酵母菌株PCR 擴增的結果Fig.1 The PCR results of yeasts

2.3.2 酵母ITS 序列相似性Blast 查詢結果

酵母ITS 序列相似性Blast 查詢結果見表2。

表2 酵母ITS 序列相似性Blast 查詢結果Table 2 ITS sequence of yeasts similarity Blast query results

2.3.3 酵母菌菌株系統進化樹

測序結果用Blast 在GenBank 中進行同源性比對，選取模式菌株以領域連接法構建系統發育樹，見圖2。

由圖2可知，所測10 株酵母菌中有3 株酵母菌均同為 Pichia kudriavzevii，3 株酵母菌為 Saccharomyces cerevisiae，1 株酵母菌為 Pichia anomala，2 株酵母菌為Kluyveromyces marxianus，1株酵母菌為Clavispora lusitaniae。

2.4 獼猴桃汁發酵樣品揮發性成分分析

通過“1.3.3”試驗篩選出的酵母菌CK-03 用于發酵產香研究，對發酵樣品采用GC-MS 分析，總離子流圖見圖3。

經過Nist11 譜庫檢索得到揮發性化合物的種類，計算相對含量結果見表3。

圖2 酵母菌菌株基于26S rDNA 的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of yeast strains based on 26S rDNA analyses

圖3 酵母CK-03 發酵樣品揮發性成分的GC-MS 總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of volatile components with yeast strains CK-03 fermentation

表3 酵母CK-03 發酵樣品的主要揮發性成分Table 3 Volatile components with yeast strains CK-03 fermentation

樣品共檢出25 種揮發性成分，其中酯類10 種，醇類 4 種，酸類6 種、醛類 1 種、烷烴2 種。醇類物質和酯類物質是構成發酵樣品香氣的主要成分，醇類組分含量較高，其中異戊醇、苯乙醇、2-甲基丁醇的相對含量分別為25.64%、8.18%、7.33%。異戊醇具有酒香和果香的味道，苯乙醇具有呈香、呈味作用[20]。酯類物質種類最多，其中乙酸乙酯、4-己烯酸乙酯、辛酸乙酯含量較高，分別為3.93%、2.87%、1.82%，其他酯類還有乙酸異戊酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯等，辛酸乙酯具有白蘭地酒香氣，癸酸乙酯具有果香和花香的香氣[21]，這些酯類產生的香氣相互綜合，賦予發酵樣品濃郁的酯香。此外，在發酵樣品中還檢測到6 種酸類、1 種醛類和2 種烷烴。這些物質含量底，可能對發酵樣品香氣的直接貢獻不大，但對發酵樣品復雜的香氣做出了貢獻。

3 結論

本試驗從種市售酒曲樣品中分離出10 株酵母菌，經過形態鑒定和系統發育樹分析，確定酵母菌CK-02、CK-04、CK-05 為 Pichia kudriavzevii，酵母菌 CK-03、CK-08、CK-10 為 Saccharomyces cerevisiae，酵母菌CK-09 為 Pichia anomala，酵母菌 CK-01、CK-06 為Kluyveromyces marxianus，酵母菌CK-07 為Clavispora lusitaniae，表明不同酒曲的酵母菌株有較大差異。將粗篩后的酵母CK-03 發酵獼猴桃汁，經GC-MS 測定分析，發酵樣品中含有多種揮發性成分，主要成分是醇類物質和酯類物質。CK-03 酵母菌的發酵工藝特性還有待進一步研究。