銅綠假單胞菌對煙曲霉菌不同時期的抑制作用觀察

李更森 孔晉亮 羅勁

對于各種原因導致的呼吸道慢性感染患者而言，長期反復及經久不愈的感染不僅會增加病死率、降低生活質量、加重心理負擔，亦會大大增加醫療資源的消耗。在眾多呼吸道慢性感染的常見致病菌中，銅綠假單胞菌及煙曲霉菌是最常見的條件致病菌，且兩者常常混合存在，尤其見于老年慢性感染患者中[1]。既往的相關研究已經明確，銅綠假單胞菌及其產生的小分子物質如葵醇、葵酸、十二醇等能夠抑制煙曲霉生物被膜的形成[2]。但其對煙曲霉孢子期及菌絲期、早期生物被膜的作用研究目前尚未涉及。煙曲霉在生長過程中經歷的幾個階段各有特點：在第4小時孢子黏附；8h孢子開始萌芽；10～12h菌絲延長形成單細胞層；16～20h菌絲纏繞形成多層立體結構；24h形成早期生物被膜；48～72h生物膜逐漸成熟[3]。為觀察銅綠假單胞菌對煙曲霉不同時期（孢子期、菌絲期、早期生物被膜）的作用特點，從而進一步了解銅綠假單胞菌對煙曲霉菌的抑制作用及機制，為臨床用藥時限及治療銅綠假單胞菌、煙曲霉菌的混合感染提供參考依據。本實驗通過體外建立銅綠假單胞菌分別與煙曲霉孢子、煙曲霉菌絲期及煙曲霉早期生物被膜混合的三種模型檢測所形成的生物被膜量，用結晶紫半定量法、二甲氧唑黃（XTT）比色法、正置電子顯微鏡，從半定量角度和形態學比較這三種混合模型的差異及差異形成的具體機制。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要實驗材料野生型銅綠假單胞菌菌株PAO1（本實驗室保存）；煙曲霉菌株（我院檢驗科2017年7～9月臨床分離煙曲霉共3株）。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA，中國路橋技術責任有限公司）；RMPI-1640粉（Gibico公司）；3-（N-嗎啉基）丙磺酸-4-嗎啉丙磺酸（MOPS，美國Sigma公司）；結晶紫粉末（天津紅巖試劑廠）溶解于滅菌去離子水配制成濃度為0.5%的結晶紫溶液；XTT細菌增殖及細菌毒性檢測試劑盒（美國Sigma公司）。圓形玻璃細胞爬片（直徑13mm，天津博泰克科技公司）作為生物被膜載體，高壓滅菌備用；智能生化培養箱（常州市偉嘉儀器制造有限公司SPX250）；酶標儀（美國 Thermo Multiskan MK3）；正置熒光相差顯微成像系統（OL YMPUS BX53F）。

1.2 銅綠假單胞菌菌液及不同時期煙曲霉菌的制備

1.2.1 銅綠假單胞菌野生菌株菌液的制備 挑取PAO1單菌落，接種于20ml MOPS緩沖后pH為7.0的RPMI-1640液中，37℃恒溫搖床孵育20～24h（轉速220r/min）后，分別用MOPS緩沖后pH為7.0的RPMI-1640液稀釋10倍，使其終濃度均為1×106CFU/ml。

1.2.2 煙曲霉孢子懸液的制備 受試煙曲霉菌株接種至PDA斜面培養基，37℃恒溫復蘇72h，轉接種于另一PDA斜面培養基37℃活化72h，用8ml含0.025%Tween-20的PBS沖洗PDA斜面收集孢子，20ml MOPS緩沖后pH為7.0的RPMI-1640重懸孢子，血細胞計數板調節孢子濃度為1×106CFU/ml，作為建立體外混合菌液孢子懸液。

1.2.3 煙曲霉菌絲期的制備 受試煙曲霉菌株接種至PDA斜面培養基，37℃恒溫復蘇72h，轉接種于另一PDA斜面培養基37℃活化72h，用8ml含0.025%Tween-20的PBS沖洗PDA斜面收集孢子，20ml MOPS緩沖后pH為7.0的RPMI-1640重懸孢子，血細胞計數板調節孢子濃度為1×106CFU/ml，于預混前16h接種于滅菌24孔細胞培養板。

1.2.4 煙曲霉早期生物被膜的制備 受試煙曲霉菌株接種至PDA斜面培養基，37℃恒溫復蘇72h，轉接種于另一PDA斜面培養基37℃活化72h，用8ml含0.025%Tween-20的PBS沖洗PDA斜面收集孢子，20ml MOPS緩沖后pH為7.0的RPMI-1640重懸孢子，血細胞計數板調節孢子濃度為1×106CFU/ml，于預混前24h接種于滅菌24孔細胞培養板。

1.3 菌株分組及處理每孔已事先各放置一枚滅菌圓形玻璃細胞爬片。各孔液體總量為1 000μl。實驗分為4組：PAO1+煙曲霉孢子（孢子組）；PAO1+煙曲霉菌絲（菌絲組）；PAO1+煙曲霉早期生物被膜（早期生物被膜組）；空白組。其中菌絲組中已于16h前將制備好的煙曲霉孢子懸液放置于相應孔中，早期生物被膜組中已于24h前將制備好的煙曲霉孢子懸液放置于相應孔中，并于37℃恒溫箱中孵育。16h或24h后用滅菌PBS輕輕漂洗去除相應組中浮游菌。

1.4 煙曲霉生物被膜厚度觀察按照上述方法混合24h后，棄去培養基，用滅菌PBS輕輕漂洗各孔3次以去除浮游菌，并盡量抽凈各孔內剩余PBS。于各孔加入2%戊二醛溶液1ml室溫固定2h。吸凈戊二醛后室溫干燥。各孔加入0.5%結晶紫1ml染色15min，再輕輕漂洗每孔內未粘附的結晶紫，室溫干燥后每孔加入1ml 95%乙醇溶液脫色10min。各孔吸取100μl洗脫液加入96孔板。酶標儀590nm波長測定各孔吸光度值。每組每次分別設置3個復孔取其平均值，實驗獨立重復3次。

1.5 煙曲霉生長動力學檢測按照上述方法混合24h后，棄去培養基，用滅菌PBS輕輕漂洗各孔3次以去除浮游菌，并盡量抽凈各孔內剩余PBS。各孔加入 500μl XTT和維生素 K3混合溶液，于35℃～37℃避光靜止孵育2～3h。吸取100μl孔內的XTT和維生素K3混合液，置于96孔酶標板中，用多功能酶標儀測定每孔在波長490 nm處的OD值。采用XTT比色法，490nm處測得各組平均OD值后計算各組內活菌的百分率（XTT%）=OD490處理組/OD490空白組×100%。

1.6 煙曲霉菌絲生長觀察按照上述方法混合24h后，棄去培養基，用滅菌PBS輕輕漂洗各孔3次以去除浮游菌，并盡量抽凈各孔內剩余PBS。于各孔加入2%戊二醛溶液1ml室溫固定2h。吸凈戊二醛后室溫干燥。各孔加入0.5%結晶紫1ml染色15min，室溫干燥后分別于放大5倍、10倍顯微鏡鏡下觀察。

1.7 統計學方法采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析及LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結晶紫法半定量檢測結果混合后共同培養24h測得的OD值進行比較，肉眼可見：早期生物被膜組較菌絲組厚度增加且染色明顯加深，菌絲組較孢子組厚度增加且染色加深。三組OD值兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 590nm處測得各組平均OD值（結晶紫原位染色法）

2.2 XTT比色法對三組生長動力學檢測結果混合后共同培養24h測得的OD值進行比較，肉眼可見：早期生物被膜組較菌絲組橙紅色明顯加深，菌絲組較孢子組橙紅色加深。三組OD值兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 XTT比色法對三組生長動力學檢測結果

2.3 正置顯微鏡觀察各組結構早期生物被膜組菌絲密度高，較致密。菌絲組所形成的菌絲密度及數量均較早期生物被膜組減低。孢子組幾乎未見完整菌絲形成。見圖2。

圖2 顯微鏡下各組結構

3 討論

臨床中呼吸系統疾病如支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病繼發肺感染、肺結核等常見疾病，其患者的肺部是受復雜微生物生態影響的獨特環境。但目前為止，對于如支氣管擴張繼發感染的肺內常見細菌-真菌混合感染的相關研究相對較少。在這種細菌-真菌的混合感染中，細胞-細胞之間的信號傳導系統被認為起著主要作用。細菌與真菌在該種微環境中相互競爭及協作的關系有助于其在肺內持續存在的能力。銅綠假單胞菌及煙曲霉菌經常會被從支氣管擴張的患者深部痰液分離出來，通常，年滿18歲的支氣管擴張患者，會有80%左右感染銅綠假單胞菌，而這部分患者中煙曲霉菌的感染率會有些變化[4，5]。但一項關于臨床抗真菌及抗細菌藥物對于支擴患者感染銅綠假單胞菌及煙曲霉菌的作用研究表明，銅綠假單胞菌不能完全抑制煙曲霉菌[6]。以上這些數據顯示銅綠假單胞菌和煙曲霉菌之間存在拮抗關系，這種拮抗關系與煙曲霉菌的狀態及不同時期階段有關。在煙曲霉孢子期加入銅綠假單胞菌混合24h后，可見煙曲霉仍呈孢子狀態，幾乎很少萌發成菌絲，說明銅綠假單胞菌對孢子期的煙曲霉均有明顯的抑制作用。這種情況可能與煙曲霉菌受到銅綠假單胞菌分泌的一些小分子物質如葵醇、葵酸、十二醇等所形成的抑制作用有關。對于煙曲霉菌絲期加入銅綠假單胞菌混合作用24h后，可見有較多煙曲霉菌絲形成，但有些菌絲的萌發能力不全即不能形成完整的菌絲結構，菌絲胞壁厚度相對較薄。說明銅綠假單胞菌對菌絲期的煙曲霉仍具有一定的抑制其生長萌發的作用，但相對于孢子期的抑制作用則大大減弱。這可能與此時煙曲霉菌絲所形成的胞外基質中已含有較多的β-1，3-葡聚糖，銅綠假單胞菌通過分泌其自身的密度感應信號分子las、rhl、pqs來抑制煙曲霉中的β-1，3-葡聚糖，從而抑制煙曲霉菌絲的生長有關。但是這種抑制作用遠不及煙曲霉本身萌發成菌絲及菌絲繼續生長的能力。對于煙曲霉早期生物被膜形成后加入銅綠假單胞菌混合作用24h后，無論從結晶紫半定量檢測還是XTT比色法生長動力學檢測，亦或是顯微鏡下直觀觀察煙曲霉菌所形成的狀態，均證實，此期加入的銅綠假單胞菌對于煙曲霉菌所形成的早期生物被膜相對于前兩組而言均無明顯的抑制作用，煙曲霉菌絲密度大，菌絲胞壁較厚，可見滿視野的成熟完整菌絲結構。眾所周知，生物被膜的特性完全不同于浮游菌的生物學特性，混合菌形成的混合生物被膜中，細菌和細菌或細菌和真菌之間的相互作用是通過密度感應分子來相互作用的。對于銅綠假單胞菌而言，其主要的密度感應系統包括las、rhl、pqs三個系統。而對于煙曲霉而言，其主要的密度感應系統目前還沒有明確定論。此時除了煙曲霉菌絲所形成的胞外基質中已含相當多的β-1，3-葡聚糖外，有研究表明，煙曲霉在形成生物被膜過程中會產生膠霉毒素[7]，膠霉毒素（gliotoxin，GT）是一種重要的疏水性真菌代謝產物，屬于表聚硫代哌嗪二酮類化合物（Epidithiodiketopiperazines，ETPs）[8]。已有研究表明，與傳統培養條件（低氧、室溫）相比，37℃條件下培養的煙曲霉生成GT的速度明顯加快，培養24h即可檢測到GT，培養48～72h達到峰值，且煙曲霉生成GT具有氧氣依賴性[9，10]。兩者均會對銅綠假單胞菌產生抵抗作用，從而削弱了銅綠假單胞菌對煙曲霉菌生物被膜的抑制作用。

綜上所述，銅綠假單胞菌對于煙曲霉菌孢子期及菌絲期均有抑制作用，而對煙曲霉已經形成的早期生物被膜而言這種抑制作用明顯減弱。預示著在生物體內定植的銅綠假單胞菌會對煙曲霉菌具有抑制作用，在臨床藥物研究中可研發一些與銅綠假單胞菌相關的小分子物質來抑制煙曲霉菌，產生一種新的療法，以更有效地管理曲霉菌病。