克羅米芬促排卵周期中應用壽胎丸對小鼠著床窗口期子宮內膜及其容受性、妊娠結局的影響▲

李 楠 王麗君 張 輝

(陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院婦科，咸陽市 712000，電子郵箱：linan_80_311@163.com)

臨床上，克羅米芬用于治療排卵障礙性不孕癥，具有價格低廉、口服給藥、使用安全等優(yōu)點[1]。但是由于克羅米芬同時具有抗激素作用，易造成子宮內膜容受性下降而出現(xiàn)“高排低孕”現(xiàn)象。中醫(yī)藥治療是解決克羅米芬負面效應的有效方法之一。為了明確中醫(yī)藥壽胎丸對子宮內膜容受性的影響，本研究建立克羅米芬誘發(fā)排卵模型，觀察壽胎丸對著床窗口期子宮內膜形態(tài)、厚度，子宮內膜容受性標志物白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的表達，以及對妊娠率的影響，為中藥輔助促排卵藥物提高妊娠率提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：成熟期、未孕雌性ICR系無特定病原體小鼠，6～8周齡，體重(30±5)g，清潔級性成熟雄性小鼠體重，6～8周齡，體重(30±5)g，均由成都達碩實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(川)2015-030。喂養(yǎng)條件：室溫(20±2)℃，自由攝食、飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 藥物：枸櫞酸氯米芬膠囊(商品名：克羅米芬)購自康和藥業(yè)(批號：k0702)，人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)購自上海麗珠集團麗珠制藥廠(批號：170901-1)。壽胎丸由菟絲子、續(xù)斷、桑寄生、阿膠組成，均由陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科對中藥材的來源及品種進行鑒定后，采用水提醇沉法制備藥液，藥物終濃度為1 g生藥/mL， 4℃冰箱保存。

1.1.3 主要試劑及儀器：蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色液(批號：C0105)購自碧云天生物技術公司，4%多聚甲醛(批號：P8430-25)、1%氯化氫-75%乙醇(批號：80176961)、氫氧化鈉堿液(批號：C380215000)、95%乙醇(批號：10009128)、80%乙醇(由95%乙醇配制)、丙三醇(批號：40025861)、二甲苯(批號：10023418)、磷酸緩沖鹽溶液(批號：GL1263)、0.01%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，批號：A30313503)均購自中國國藥集團，濕盒(批號：YA0764)購自上海索萊寶生物科技有限公司，辣根過氧化物酶標記二抗(批號：A0216)購自碧云天生物技術公司，二喹啉甲酸蛋白定量測定試劑盒(批號：PT0001)購自武漢博士德生物工程有限公司，聚偏氟乙烯膜(批號：ISEQ00010)購自美國Millipore公司，電化學發(fā)光試劑(批號：32109)購自德國Roche公司，兔抗LIF多克隆抗體(批號：sc-20087)購自美國Santa Cruz公司，PrimeScriptTMRT試劑盒(批號：RR037Q)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑(批號：RR820L)均購自TaKaRa公司。CM3050S型冷凍切片機、IX71型倒置顯微鏡均購自Leica公司，StepOnePlus型實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司，Trans-Blot型電泳及轉膜設備購自美國Bio-Rad公司，2-16k型離心機購自德國Sigma公司，LS-2型超凈工作臺購自北京安泰公司，S648型電熱恒溫水箱購自上海醫(yī)療器械廠，XSZ-81型光學顯微鏡購自廣西梧州市光學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 分組方法：每日將棉簽蘸少許生理鹽水后，于雌性小鼠陰道壁外1/3處旋轉一圈后取出，行陰道涂片，均勻涂于載玻片上，晾干后用95%乙醇固定30 min；洗去玻片上的乙醇，經(jīng)蘇木素染色5 min，流水沖凈，置入酸性乙醇分化液中浸提2次，每次不超過10 s，清水洗滌去除多余分化液；將載玻片經(jīng)伊紅染色3 min，自來水洗滌；干燥后在顯微鏡下觀察并記錄。連續(xù)觀察2個動情周期，將具有規(guī)律動情周期的90只雌性小鼠納入本研究。從第3個動情周期開始實驗。采用隨機數(shù)字表法將雌鼠分為對照組、克羅米芬組和中藥組，每組30只。

1.2.2 給藥方法：小鼠動情周期為4～5 d，分為動情前期、動情期、動情后期、動情間期，于動情前期參照文獻[2]用藥，參照小鼠等效劑量相當于人用劑量的9.1倍，計算小鼠灌胃劑量。對照組按照1 mL/100 g灌服生理鹽水，1次/d，直至合籠后第4天。克羅米芬組按照140 mg/(kg·d)給予克羅米芬，每次按1 mL/100 g灌服，1次/d，連續(xù)2 d；合籠后12 h開始按照1 mL/100 g灌服生理鹽水，1次/d，直至合籠后第4天。中藥組在克羅米芬組基礎上，從合籠后12 h開始按1 mL/100 g灌服中藥，1次/d，直至合籠后第4天。在連續(xù)灌胃2 d后上午8時，給各組小鼠腹腔內注射HCG 5 IU，注射后12 h與雄性小鼠合籠，雌雄比例為2 ∶1。合籠后第4天，每組各處死10只雌性小鼠，觀察妊娠數(shù)，并取子宮觀察內膜厚度和形態(tài)學變化，并檢測著床窗口期LIF的表達；分別于第5天、第7天每組各處死10只雌性小鼠，觀察各組的妊娠數(shù)。

1.2.3 HE染色觀察著床窗口期子宮內膜形態(tài)學變化：合籠后第4天，小鼠斷頸處死，于75%乙醇中浸泡消毒5～10 min。無菌條件下，用生理鹽水沖洗小鼠子宮，體式顯微鏡下檢到囊胚，則確定為妊娠小鼠，隨即留取整個子宮，放置于4%多聚甲醛中固定24 h。將小鼠子宮包埋于包埋劑后，于冷凍切片機上切片，設置切片厚度為5 μm。選取平整的切片進行HE染色。將切片于4%多聚甲醛中固定10～30 s，水洗；染蘇木素3～5 min，水洗；1%氯化氫-75%乙醇分化5～10 s，水洗；用堿水促藍20 s，水洗；伊紅染色30～60 s，水洗；80%乙醇洗3～5 s，95%乙醇洗3～5 s，無水乙醇洗3～5 s，丙三醇封片。倒置顯微鏡下采用Leica Qwin Plus圖像處理軟件觀察著床窗口期子宮內膜厚度，以及腺體的周長、面積和最大直徑。

1.2.4 檢測著床窗口期小鼠子宮內膜LIF蛋白的表達：獲取合籠后第4天的妊娠小鼠子宮組織。將組織標本經(jīng)預冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，剪成約為0.5 g的多個組織塊，加液氮研磨后加入RIPA裂解液，超聲波破碎，冰浴裂解30 min。4℃下15 000 r/min離心20 min，取上清，采用二喹啉甲酸蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。隨后向蛋白中加入上樣緩沖液，100℃水浴10 min使蛋白變性。用濕轉法將蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜上，轉膜后用含10%脫脂奶粉的TBST(20 nm三羥甲基氨基甲烷，150 nm氯化鈉，0.05% Tween-20)室溫封閉2 h，隨后將膜轉入含有兔抗LIF多克隆抗體的封閉液中，4℃過夜孵育。一抗孵育結束后用TBST洗膜3次，10 min/次。洗滌后的膜放入含有辣根過氧化物酶標記的二抗封閉液中，室溫孵育2 h。孵育結束后用TBST洗膜3次，10 min/次。洗滌后的膜用化學底物發(fā)光法進行顯色，然后到暗室中曝光。采用Quantity One軟件進行對特異蛋白條帶進行灰度掃描和定量分析。

1.2.5 著床窗口期小鼠子宮內膜LIF mRNA的表達：獲取合籠后第4天的妊娠小鼠子宮組織。利用TRIzol法提取RNA，反轉錄合成cDNA后，以各組子宮內膜的cDNA為模板，利用特異性定量引物進行RT-qPCR反應，基因特異性引物見表1，每個樣品重復3次。反應體系為20 μL，包括2×SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上游引物(10 μm)0.8 μL，下游引物(10 μm)0.8 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，模板(cDNA)2 μL，雙蒸水6 μL。RT-qPCR反應程序為95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s，共40個循環(huán)，行溶解曲線分析。實驗選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參基因。采用2-△△CT法計算mRNA表達量，每組數(shù)據(jù)值取3個獨立樣品的平均數(shù)。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.6 妊娠率的計算：合籠后第4天、第5天、第7天，摘取各組小鼠子宮，記錄孕鼠數(shù)。生理鹽水沖洗子宮，體式顯微鏡下觀察是否有胚胎，有胚胎者視為孕鼠，無胚胎者視為未孕。總妊娠率=(總孕鼠數(shù)/交配雌鼠數(shù))×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用(x±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較選擇LSD-t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)(率)表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3組小鼠著床窗口期子宮內膜厚度及形態(tài)學變化 合籠后第4天，與其他兩組比較，克羅米芬組的子宮內膜厚度變薄，腺體周長、面積和最大直徑均較小(均P<0.05)，而中藥組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表2。鏡下觀察到對照組小鼠子宮內膜腺體數(shù)量增多，間質疏松、水腫，血管彎曲，管腔擴張，腺腔分泌豐富；克羅米芬組小鼠子宮內膜腺體排列稀疏，腺上皮呈低柱狀，間質致密，部分腺腔內見空泡；中藥組小鼠子宮內膜腺體腺上皮呈高柱狀，腺腔內見較多空泡，間質疏松，血管延長，腺體數(shù)目及成熟度接近對照組。見圖1。

表2 3組小鼠著床窗口期子宮內膜厚度及形態(tài)學的比較(x±s)

注：與對照組比較，aP<0.05；與中藥組比較，bP<0.05。

對照組 中藥組 克羅米芬組

圖1 3組小鼠著床窗口期子宮內膜形態(tài)學變化(HE染色，×200)

2.2 3組小鼠著床窗口期子宮內膜LIF mRNA及蛋白表達水平比較 合籠后第4天，與對照組及中藥組比較，克羅米芬組著床窗口期子宮內膜LIF mRNA及蛋白的表達均降低(均P<0.05)，見圖2及表3。

圖2 3組小鼠著床窗口期子宮內膜LIF蛋白表達情況

組別nLIF蛋白LIF mRNA對照組 80.95±0.031.59±0.05中藥組70.91±0.021.56±0.04克羅米芬組50.75±0.02a1.37±0.03a F值64.83050.590P值<0.001<0.001

注：與對照組和中藥組比較，aP<0.05。

2.3 3組小鼠總妊娠率比較 克羅米芬組、對照組、中藥組的總妊娠率分別為50.0%(15/30)、83.3%(25/30)、76.7(23/30)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=0.889，P=0.012)。其中克羅米芬組的總妊娠率低于其他兩組(P<0.05)，而對照組與中藥組的總妊娠率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組小鼠妊娠情況(n)

3 討 論

胚胎的質量和子宮內膜的容受性是影響妊娠率的兩個關鍵因素，其中60%以上的胚胎種植失敗與子宮內膜微環(huán)境改變及容受性不良有關[3]。克羅米芬作為治療排卵障礙性不孕癥的一線藥物，應用過程中其會影響子宮內膜厚度及宮頸黏液的產(chǎn)生，造成子宮內膜出現(xiàn)低容受性而導致妊娠率降低。子宮內膜薄、血流不足、內膜成熟延遲可導致周期妊娠率低。因此，通過增加內膜的厚度及血供，促進內膜成熟，使之與卵泡發(fā)育同步化是提高子宮內膜容受性及妊娠率的必要條件。臨床中常通過補充雌激素促進子宮內膜生長，并通過口服阿司匹林改善內膜下血流來提高內膜容受性。近年來，有研究顯示中醫(yī)藥有助于促排卵，提高臨床妊娠率[4-5]，這充分顯示了中醫(yī)藥在助孕方面的整體優(yōu)勢。一項Meta分析顯示，相較于單純克羅米芬治療，在克羅米芬促排卵過程中聯(lián)合補腎中藥治療多囊卵巢綜合征，可提高排卵率和妊娠率[6]，這為進一步研究補腎中藥提高妊娠率的機制提供了證據(jù)支持。

壽胎丸出自著名醫(yī)家張錫純所著的《醫(yī)學衷中參西錄》[7]，其由菟絲子、續(xù)斷、桑寄生、阿膠四味藥物組成，原方用于治療滑胎和預防流產(chǎn)。作為固腎安胎第一方，該方劑已經(jīng)成為臨床中應用最廣、報道最多、療效最為顯著的方劑，用于治療先兆流產(chǎn)、不明原因反復流產(chǎn)等[8-9]。鑒于壽胎丸的有效性，近年來有學者對該方劑開展了廣泛而深入的研究臨床及基礎[10-11]，并延伸到輔助生殖技術領域[12]。研究表明，壽胎丸能增加子宮內膜厚度，提高生育能力和胚胎質量，促進胚胎著床，從而提高體外受精-胚胎移植周期的成功率[13]。另有實驗結果表明，壽胎丸加減方可提高超排卵小鼠種植窗期子宮內膜的容受性[14]。此外，壽胎丸的雌激素樣活性，可明顯降低復發(fā)性流產(chǎn)小鼠胚胎丟失率，調節(jié)流產(chǎn)小鼠蛻膜組織中多種蛋白質表達，促進早孕期胎盤分泌絨毛膜促性腺激素，調節(jié)母胎界面的內分泌及免疫網(wǎng)絡分子水平，并提高孕激素水平，從而改善黃體功能，且在合理劑量下對胚胎發(fā)育無明顯毒性[15-19]。

本研究結果顯示，合籠后第4天，中藥組小鼠子宮內膜厚度雖不及正常組厚，但較克羅米芬組增厚(P<0.05)，提示受抑制的內膜得到了逆轉。鏡下觀察到克羅米芬組子宮內膜腺體排列稀疏，腺上皮呈低柱狀，間質致密，部分腺腔內見空泡；而中藥組子宮內膜腺體腺上皮呈高柱狀，腺腔內見較多空泡，間質疏松，血管延長，腺體數(shù)目及成熟度接近對照組。提示中藥組小鼠子宮內膜腺體、間質及血管發(fā)育較成熟，接近于正常小鼠，說明壽胎丸雌激素樣活性，彌補了克羅米芬造成的內源性雌激素不足的缺陷，促進子宮內膜的快速恢復，為胚胎著床提供適宜的子宮內膜厚度和良好的內膜容受性。本研究中，中藥組的總妊娠率高于克羅米芬組(均P<0.05)，提示壽胎丸對胚胎的黏附和植入過程中的子宮內膜局部微環(huán)境有正向調節(jié)作用。

LIF是一種多效性的分泌型糖蛋白，屬于白細胞介素6超家族的成員，與相應的受體結合后在細胞生長、增殖和分化中發(fā)揮廣泛的作用，與胚胎種植相關[20]。有實驗表明，LIF基因敲除的小鼠不能發(fā)生胚胎種植，但將基因敲除的小鼠的胚胎種植在正常小鼠或敲除基因后再給予LIF，仍可使胚胎種植[21]。因此，LIF可影響子宮內膜的容受性。本研究結果顯示，克羅米芬組子宮內膜LIF mRNA及蛋白表達均較對照組和中藥組下降(均P<0.05)，而中藥組與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這從分子角度證明了克羅米芬對子宮內膜容受性有負面影響，而在克羅米芬促排卵周期中應用壽胎丸有利于改善子宮內膜容受性，從而提高妊娠率。

綜上所述，壽胎丸能夠改善克羅米芬促排卵后子宮內膜厚度，增強LIF在內膜中的表達。因此，可以在促排卵助孕周期加用壽胎丸作為輔助治療，以改善著床窗口期子宮內膜容受性，以提高臨床妊娠率。