N,N′-二環(huán)己基-N-亞麻酸酰脲的體外抗腫瘤活性▲

翚明莉 莫斯銳 歐冰凝 秦 箐

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，南寧市 530021，電子郵箱：540993602@qq.com；2 右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，3 廣西高校右江流域特色民族藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，百色市 533000)

我國癌癥的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，其死亡率僅次于心血管疾病[1]。目前，治療癌癥的方法主要有傳統(tǒng)手術(shù)、化療和放療，但這些方法的副作用較大，因此中藥提取物及其抗癌中藥配伍成為抗癌研究的熱點(diǎn)[2]。板藍(lán)根性寒味苦，具有清熱解毒、涼血利咽的功效。本課題組前期從板藍(lán)根中分離提取出一組高級不飽和脂肪酸，又稱板藍(lán)根組酸，發(fā)現(xiàn)其具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤活性[3]；再以板藍(lán)根組酸為先導(dǎo)化合物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)該化合物結(jié)構(gòu)中的羧基既是抗腫瘤活性基團(tuán)，也是溶血基團(tuán)[4]。因此，我們進(jìn)一步對羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾并進(jìn)行抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)N,N′-二(2-氯乙基)-芥酸酰胺(即化合物J)具有良好的抗腫瘤活性和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用[5-6]，而N,N′-二環(huán)己基-N-山崳酸酰脲(即化合物K)具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用[7]，但兩者水溶性較差，在水溶液中易析出，不利于體外實(shí)驗(yàn)的量效評價，因此進(jìn)一步對碳鏈進(jìn)行修飾，獲得到具有良好抗腫瘤活性的化合物N,N′-二環(huán)己基-N-亞麻酸酰脲(即化合物MSR405)[8]。本研究從細(xì)胞水平探討化合物MSR405的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：8117256)、杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(批號：8116486)均購自美國Gibco公司，胎牛血清(批號：18050302)購自杭州四季青生物工程材料有限公司，1×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline,PBS；批號：20180627)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(批號：20180815)、青霉素/鏈霉素混合液(批號：20180306)、吖啶橙-溴乙錠雙染試劑盒(批號：CA1140)均購自北京索萊寶科技有限公司，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT；批號：1123A053)購自美國Sigma公司，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號：1957502)購自Thermo Fisher Scientific公司。化合物由本課題組合成純化而來，合成方法參照文獻(xiàn)[8]。

1.1.2 儀器：水浴鍋(型號：WB-2000)購自鄭州長城科工貿(mào)有限公司，小型高速離心機(jī)(型號：Micro17R)購自Thermo Fisher Scientific公司，連續(xù)光譜掃描儀(型號：SpectraMAX Plus384)購自香港分子儀器公司，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(型號：Scientific 3111)購自德國Thermo Forma公司，倒置顯微鏡(型號：CKX-41)購自日本Olympus公司、十萬分之一電子天平(型號：XS205DU)購自梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司，流式細(xì)胞儀(型號：FACS Cliblur)購自美國BD公司。

1.1.3 細(xì)胞株：肝癌細(xì)胞株Bel-7402購自上海美軒生物科技有限公司，肝癌細(xì)胞株Hep-G2、肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、卵巢癌細(xì)胞株SKOV3均由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室傳代。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MSR405體外抗腫瘤活性篩選：用含0.25%乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的肝癌細(xì)胞株Bel-7402、Hep-G2、SMMC-7721和卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，室溫下8 000 r/min離心5 min后重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，以每孔100 μL接種細(xì)胞于96孔板中，PBS封邊，于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，分為陰性對照組(不加藥組)、空白調(diào)零組(無細(xì)胞無藥組)、MSR405藥物組(藥物濃度分別為500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL)，每組設(shè)4個復(fù)孔。給藥24 h后棄去培養(yǎng)基，每孔避光加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，在恒溫培養(yǎng)箱中避光繼續(xù)孵育4 h后棄掉MTT，每孔加入150 μL二甲基亞砜，于搖床上搖勻，放置在酶標(biāo)儀上，于波長490 nm處測定A值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值計算抑制率。抑制率=[(陰性對照組A值-空白凋零組A值)-(MSR405藥物組A值-空白凋零組A值)]/(陰性對照組A值-空白凋零組A值)×100%。

1.2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況：用含0.25%乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞Bel-7402、SMMC-7721，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/mL，以1 mL/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別給予藥物濃度為60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL的MSR405，24 h后收集所有細(xì)胞，以不給藥的細(xì)胞作為陰性對照，嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，采用BD流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞在早期和晚期凋亡中的分布。

1.2.3 觀察細(xì)胞形態(tài)變化：用含0.25%乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞Bel-7402、SMMC-7721，室溫下8 000 r/min離心5 min重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/mL，以1 mL/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別給予藥物濃度分別為60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL的MSR405，給藥24 h后用1×PBS洗去漂浮的死細(xì)胞，然后每孔加1 mL PBS、10 μL吖啶橙染料和10 μL溴乙錠染料，室溫放置2～5 min后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。在熒光顯微鏡下可觀察到4種細(xì)胞形態(tài)，其中核染色質(zhì)呈綠色且細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常為活細(xì)胞，核染色質(zhì)呈綠色且細(xì)胞結(jié)構(gòu)固縮為早期凋亡細(xì)胞，核染色質(zhì)呈橘紅色且細(xì)胞結(jié)構(gòu)固縮為晚期凋亡細(xì)胞，核染色質(zhì)呈橘紅色且細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常為非凋亡的死亡細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料均以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度MSR405對不同癌細(xì)胞增殖的抑制作用 陰性對照組對不同癌細(xì)胞增殖的抑制作用均為0，不同濃度MSR405作用下，Bel-7402、SMMC-7721、Hep-G2肝癌細(xì)胞株和SKOV3卵巢癌細(xì)胞株的增殖均受不同程度地抑制，見表1。

表1 不同濃度MSR405干預(yù)下不同癌細(xì)胞的增殖抑制率(x±s，%)

2.2 不同濃度MSR405對肝癌細(xì)胞凋亡率的影響 與陰性對照組比較，經(jīng)各濃度MSR405處理后肝癌細(xì)胞Bel-7402、SMMC-7721的凋亡率均升高(均P<0.05)。MSR405濃度為80～120 μg/mL時，兩種肝癌細(xì)胞的凋亡率隨著MSR405濃度增大而升高(均P<0.05)。見表2及圖1～圖2。

表2 不同濃度MSR405干預(yù)下肝癌細(xì)胞Bel-7402和SMMC-7721的凋亡率(x±s，%)

注：與陰性對照組比較，*P<0.05；與60 μg/mL比較，&P<0.05；與80 μg/mL比較，#P<0.05；與100 μg/mL比較，@P<0.05。

圖1 不同濃度MSR405對Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響

圖2 不同濃度MSR405對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響

2.3 不同濃度MSR405對細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響 陰性對照組以正常細(xì)胞為主，細(xì)胞呈綠色且結(jié)構(gòu)完整；各藥物組的細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈圓柱狀或固縮狀、團(tuán)塊狀，隨著化合物MSR405濃度的增加，細(xì)胞凋亡數(shù)量增加。見圖3～4。

圖3 不同濃度MSR405對細(xì)胞Bel-7402細(xì)胞形態(tài)的影響(吖啶橙-溴乙錠染色，×200)

圖4 不同濃度MSR405對細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響(吖啶橙-溴乙錠染色，×200)

3 討 論

飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸在抗腫瘤中的應(yīng)用，已成為人們關(guān)注的重點(diǎn)，尤其是多不飽和脂肪酸[9-13]。多不飽和脂肪酸是具有18～22個碳原子的碳鏈，且含有兩個或兩個以上雙鍵的直鏈脂肪酸，分為ω-6和ω-3不飽和脂肪酸兩種類型，目前ω-3不飽和脂肪酸中的二十二碳碳烯酸和二十碳五烯酸是人體最重要的不飽和脂肪酸。本研究中的化合物亞麻酸屬ω-3系列，是人體的必需脂肪酸。亞麻酸不僅具有抗腫瘤活性，還具有抗炎[14]以及輔助治療阿爾茨海默病[15]的作用，是近年來的研究熱點(diǎn)之一。

本課題組一直關(guān)注經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后可使高級不飽和脂肪酸達(dá)到高效低毒目標(biāo)的板藍(lán)根組酸，最具典型的化合物是化合物K和化合物J。本課題組的前期體外實(shí)驗(yàn)提示，化合物J在濃度低于100 μg/mL時，對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞無抑制作用，具有一定的安全性，該化合物對癌細(xì)胞的抑制效果不明顯，但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中其具有明顯的抗腫瘤作用[16]。同時，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物J具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用，其逆轉(zhuǎn)機(jī)制可能與化合物J通過下調(diào)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-π表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性增強(qiáng)有關(guān)；在體外實(shí)驗(yàn)中，化合物K濃度高于400 μg/mL時才具有抑制癌細(xì)胞增殖的作用，但在免疫調(diào)節(jié)方面，其可抑制脾細(xì)胞的增殖，與免疫抑制劑合用時可延長小鼠的生存時間，明顯降低CD4+/CD8+T細(xì)胞比例[17]。化合物MSR405是以板藍(lán)根組酸為先導(dǎo)化合物合成的，在體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，其對癌細(xì)胞的抑制作用較化合物J和化合物K更明顯[8]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度MSR405對Bel-7402、SMMC-7721、Hep-G2肝癌細(xì)胞株和SKOV3卵巢癌細(xì)胞株增殖均有不同程度的抑制作用。與陰性對照組比較，經(jīng)各濃度MSR405處理后肝癌細(xì)胞Bel-7402、SMMC-7721的凋亡率均升高(均P<0.05)，且當(dāng)濃度≥80 μg/mL時，Bel-7402和SMMC-7721細(xì)胞的凋亡率隨著MSR405濃度增大而升高；經(jīng)不同濃度MSR405處理后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈圓柱狀或固縮狀、團(tuán)塊狀。這提示在一定濃度范圍內(nèi)，MSR405對肝癌細(xì)胞Bel-7402、SMMC-7721的促凋亡作用呈劑量依賴性，這為板藍(lán)根組酸衍生物的抗腫瘤活性(如腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)等)及免疫調(diào)節(jié)研究奠定理論基礎(chǔ)，但其抗腫瘤機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，MSR405對Bel-7402、SMMC-7721、Hep-G2和SKOV3細(xì)胞株的增殖均有不同程度的抑制作用，在一定濃度范圍內(nèi)其對肝癌細(xì)胞Bel-7402、SMMC-7721的促凋亡作用呈劑量依賴性。