JMY蛋白在小鼠睪丸中的定位和作用研究

范嘉盈 劉 悅 丁之德 *

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)與遺傳發(fā)育學(xué)系（上海 200025）2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心；3.上海市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

睪丸生精小管管壁為多層的生精上皮，其中有生精細(xì)胞和支持細(xì)胞兩類形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能完全不同細(xì)胞。生精細(xì)胞從基底部至生精小管管腔排列嚴(yán)格而有序，并處于不斷增殖和分化狀態(tài)，直至精子產(chǎn)生[1]。支持細(xì)胞又稱Sertoli細(xì)胞，是睪丸生精上皮中唯一的一種特殊的體細(xì)胞，其側(cè)面鑲嵌有各級(jí)生精細(xì)胞[2]。在整個(gè)精子發(fā)生過程中，支持細(xì)胞不僅為生精細(xì)胞提供支持和營養(yǎng)，還通過復(fù)雜的細(xì)胞連接形式構(gòu)成生精上皮獨(dú)特的微環(huán)境，為生精過程穩(wěn)定而有序的進(jìn)行提供重要保障[3]，尤其是相鄰支持細(xì)胞在生精上皮基底部形成致密的細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)，即血睪屏障 （blood-testis barrier,BTB），而通過血睪屏障可阻止外界大分子抗原物質(zhì)進(jìn)入生精小管，為精子的發(fā)生提供了一個(gè)免疫豁免的微環(huán)境。

有研究發(fā)現(xiàn)，WASp家族 （Wiskott-Aldrich Syndrome family）成員之一JMY蛋白（junction-mediating and regulatory protein）對(duì)Arp2/3蛋白復(fù)合物的激活起關(guān)鍵作用，從而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白組裝，下調(diào)鈣粘蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞黏附，促進(jìn)細(xì)胞的遷移、運(yùn)動(dòng)等[4]。此外，最新研究還發(fā)現(xiàn)，JMY通過其WH2結(jié)構(gòu)域還參與了細(xì)胞內(nèi)吞和囊泡運(yùn)輸過程[5]。然而，迄今還未發(fā)現(xiàn)JMY蛋白與雄性生殖相關(guān)研究的報(bào)道。考慮到JMY同家族成員WASP和其協(xié)同分子Arp3在支持細(xì)胞及細(xì)胞連接中的功能，我們推測(cè)，JMY極有可能同樣在維持睪丸中細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)和精子發(fā)生過程扮演重要的角色。因此，我們通過免疫熒光技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)JMY在小鼠睪丸中呈高表達(dá)狀態(tài)。隨后，我們分別構(gòu)建了支持細(xì)胞特異性和原始生殖細(xì)胞特異性Jmy基因敲除小鼠模型。在此基礎(chǔ)上，通過生育力比較、精子質(zhì)量分析和形態(tài)學(xué)分析等手段，探討JMY對(duì)小鼠睪丸生精小管結(jié)構(gòu)及精子發(fā)生的影響。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

雄性與雌性C57BL/6小鼠皆購自于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，Anti-Mullerian hormone（Amh）-Cre 小鼠、Mouse-Vasa homolog（Mvh）-Cre小鼠和 Jmy-loxP 小鼠來自于上海南方模式生物研究中心。以上所有小鼠均飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，符合SPF級(jí)飼養(yǎng)條件。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵照生殖研究學(xué)會(huì)(Society of Reproductive Investigation,SRI)頒布的國際生殖科學(xué)研究指導(dǎo)原則 (International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animal)。

二、主要試劑與儀器

（一）試劑

RIPA lysis buffer(Thermo Fisher Scientific),Protease Inhibitor tablet(Thermo Fisher Scientific),兔抗鼠actin抗體 (Cell Signaling Technology),兔抗鼠JMY抗體(Abcam),AF555標(biāo)記驢抗兔二抗（Biotium）,HRP標(biāo)記馬抗兔 二 抗 （Jackson）,EZ-Link Sulfo-N HS-LC-Biotin(Pierce),FITC標(biāo)記的親和素(Jackson)。

（二）儀器

生化自動(dòng)分析儀 (Roche Diagnostics),石蠟切片機(jī)(Leica RM2235),冰凍切片機(jī)(Leica CM1850),石蠟包埋(SLEE MPS/P1),數(shù)碼顯微鏡(Nikon E600),全波長酶標(biāo)儀Multiskan GO(Thermo Fisher Scientific),凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad),全自動(dòng)精子分析儀(Hamilton Thorne),激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss)，1000/500型電泳儀和轉(zhuǎn)移儀 (Bio-Rad)。

三、方法

（一）免疫熒光鑒定JMY在小鼠睪丸中的表達(dá)和定位

取正常小鼠睪丸組織制作成冰凍切片，經(jīng)4%多聚甲醛固定、10%BSA封閉抗原配合PBS洗滌等步驟后，加入JMY一抗（1：200稀釋），對(duì)照加入同樣稀釋度的正常兔IgG，孵育過夜。次日洗滌后再加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1：400稀釋），室溫孵育1小時(shí)，洗滌且以含DAPI的抗熒光淬滅劑封片后利用激光共聚焦顯微鏡及相關(guān)軟件進(jìn)行觀察和拍攝。

（二）特異性Jmy條件基因敲除小鼠的建立

通過前期實(shí)驗(yàn)，本課題組明確了JMY在小鼠睪丸中呈高表達(dá)，為了進(jìn)一步探索JMY在小鼠睪丸中的作用，本研究利用條件基因敲除技術(shù)，將Jmy-loxP小鼠分別與Amh-Cre小鼠和Mvh-Cre小鼠雜交（Amh和Mvh分別為支持細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞早期特異表達(dá)基因。利用其啟動(dòng)子表達(dá)cre酶，可在支持細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞細(xì)胞中特異性敲除Jmy基因），構(gòu)建了支持細(xì)胞特異性Jmy基因（即Jmy-loxP/Amh-Cre）和原始生殖細(xì)胞特異性Jmy基因（即Jmy-loxP/Mvh-Cre）條件型敲除小鼠模型，從而達(dá)到有效研究JMY在睪丸中生物學(xué)功能的目的。

（三）小鼠生殖能力評(píng)估

將兩類Jmy條件基因敲除（CKO）和野生型（WT）8周齡雄性性成熟小鼠分別與10周齡野生型雌鼠合籠，觀察到陰道栓后，證明交配成功。將雌雄小鼠分籠飼養(yǎng)，觀察雌鼠懷孕情況和產(chǎn)仔數(shù)量。然后將各組生育的雌鼠交換，再次與雄鼠合籠，觀察雌鼠懷孕和產(chǎn)仔數(shù)量。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較WT組、支持細(xì)胞Jmy條件敲除（Jmy-loxP/Amh-Cre組）組和原始生殖細(xì)胞Jmy條件敲除組（Jmy-loxP/Mvh-Cre組）的生育能力。隨后，頸椎脫臼法處死小鼠取附睪尾部組織，剪破組織，置于獲能培養(yǎng)液中，在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，使精子上游。吸取上游的精子懸液，利用精液自動(dòng)分析儀（computer aided sperm analysis，CASA）檢測(cè)各組小鼠精子濃度、活動(dòng)力、前向活動(dòng)力。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較三組雄鼠精子的數(shù)量、運(yùn)動(dòng)能力。

（四）睪丸和附睪形態(tài)學(xué)檢測(cè)

取其睪丸和附睪組織置于Bouin氏固定液中固定24小時(shí)，然后組織經(jīng)梯度脫水、透明、浸蠟、包埋制成石蠟塊。利用石蠟切片機(jī)以5μm厚度切片，并將切片展平、烘干。再經(jīng)脫蠟、復(fù)水、染色、脫水、封片等環(huán)節(jié)，完成HE染色切片。光鏡下觀察生精小管組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞排列、細(xì)胞凋亡情況，比較各組差異。

（五）血睪屏障完整性檢測(cè)

將一種生物素標(biāo)記的化合物EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin（25μl）注射入小鼠睪丸間質(zhì)組織中。待化合物擴(kuò)散30分鐘后，取小鼠睪丸進(jìn)行冰凍切片，并以FITC標(biāo)記的親和素進(jìn)行染色。利用激光共聚焦顯微鏡觀察并比較各組小鼠睪丸生精小管中熒光的分布，即可判斷血睪屏障的完整性。

（六）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SAS8.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。三組均數(shù)間的比較用單因素方差分析檢驗(yàn) （One-way ANOVA），事后檢驗(yàn)用Bonfferoni檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、免疫熒光鑒定JMY在小鼠睪丸中的表達(dá)和定位

免疫熒光檢測(cè)JMY在正常小鼠睪丸中的定位，發(fā)現(xiàn)JMY蛋白分布于晚期生精細(xì)胞，特別是延長型精子細(xì)胞的核后區(qū)以及支持細(xì)胞細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)，見圖1。免疫印跡檢測(cè)同時(shí)證實(shí)JMY在小鼠睪丸、生殖細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞中呈高表達(dá)，見圖 2。

圖1 JMY蛋白在小鼠睪丸中的定位

圖2 免疫印跡檢測(cè)JMY蛋白在小鼠睪丸、生殖細(xì)胞及支持細(xì)胞中的表達(dá)

二、小鼠生殖力及精子參數(shù)結(jié)果比較

我們通過配對(duì)雌鼠的產(chǎn)仔數(shù)及雄鼠的精子質(zhì)量分析分別將兩類不同敲除組與WT組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Jmy-loxP/Mvh-Cre組即原始生殖細(xì)胞Jmy條件敲除雄性小鼠健康可育，并且其生育率和精子質(zhì)量與WT組小鼠無明顯差異（P＞0.05），而Jmy-loxP/Amh-Cre組即支持細(xì)胞Jmy條件敲除雄鼠與WT組相比則出現(xiàn)了精子質(zhì)量下降、生育力降低表型（P＜0.05），見表1。

表1 WT組與支持細(xì)胞Jmy條件敲除組和原始生殖細(xì)胞Jmy條件敲除組生殖力和精子參數(shù)比較

三、睪丸和附睪形態(tài)學(xué)變化

石蠟切片HE染色結(jié)果顯示支持細(xì)胞Jmy條件敲除組小鼠睪丸與WT組相比，生精小管中細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，生精細(xì)胞大量脫落，見圖3；而原始生殖細(xì)胞Jmy條件敲除組小鼠睪丸與WT組沒有明顯差異，其各層生精上皮細(xì)胞排列有序，生精小管管腔沒有細(xì)胞脫落，見圖3。

圖3 各組小鼠睪丸形態(tài)學(xué)檢測(cè)

四、血睪屏障完整性檢測(cè)比較

BTB完整性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，睪丸支持細(xì)胞Jmy條件敲除雄鼠其BTB屏障作用下降，生物素標(biāo)記試劑能夠穿過BTB進(jìn)入生精小管內(nèi)部，而WT和原始生殖細(xì)胞Jmy條件敲除組生精小管中BTB結(jié)構(gòu)完整，可阻擋熒光素進(jìn)入管腔，見圖4。這些結(jié)果表明JMY缺失可影響支持細(xì)胞功能，尤其是破壞BTB的完整性及干擾生精細(xì)胞對(duì)支持細(xì)胞的黏附。

圖4 各組小鼠睪丸血睪屏障完整性檢測(cè)

討 論

本研究通過免疫熒光檢測(cè)JMY蛋白在小鼠睪丸生精小管中的定位，發(fā)現(xiàn)JMY蛋白主要分布于晚期生精細(xì)胞，特別是延長型精子細(xì)胞的核后區(qū)以及支持細(xì)胞細(xì)胞核與胞質(zhì)中。為了進(jìn)一步研究JMY在生精細(xì)胞和支持細(xì)胞中的作用，我們分別建立了Jmy flox/Amh Cre（支持細(xì)胞特異性Jmy條件敲除）和Jmy flox/Mvh Cre（原始生殖細(xì)胞特異性Jmy條件敲除）小鼠模型。通過對(duì)兩種模型進(jìn)行表型分析和差異比較，探索和研究JMY蛋白在維持血睪屏障和精子發(fā)生中的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，支持細(xì)胞Jmy條件敲除雄鼠與對(duì)照的野生型小鼠比較，出現(xiàn)了精子濃度下降、精子運(yùn)動(dòng)力（包括前向運(yùn)動(dòng)力）顯著降低、生育力下降、生精小管中細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂和生精細(xì)胞大量脫落及BTB結(jié)構(gòu)受損等現(xiàn)象，而原始生殖細(xì)胞Jmy條件敲除雄鼠與對(duì)照組相比其上述檢測(cè)結(jié)果均沒有顯著差異。由此可以明確，JMY缺失對(duì)支持細(xì)胞功能影響更為明顯，其缺失可破壞血睪屏障功能，進(jìn)而干擾精子發(fā)生過程，影響精子質(zhì)量，最終導(dǎo)致雄性生育能力下降。

支持細(xì)胞是精子發(fā)生過程中生精細(xì)胞唯一的接觸者，參與構(gòu)成和維持生精上皮獨(dú)特的細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)。尤為重要的是，相鄰支持細(xì)胞在生精上皮基底部通過緊密連接（tight junction）、縫隙連接（gap junction）、類橋粒連接（desmosome-like junction）和外質(zhì)特化（ectoplasmic specialization,ES）等形成了致密的細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)，構(gòu)成了血睪屏障最重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[6,7]。值得注意的是，ES結(jié)構(gòu)是生精上皮特有的一種細(xì)胞連接形式，是由支持細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)大量特殊的肌動(dòng)蛋白微絲束（specialized actin microfilament）構(gòu)成[8,9]。由此可見，在支持細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白對(duì)于維持細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)和血睪屏障功能具有極為重要的作用，而血睪屏障對(duì)于構(gòu)建精子發(fā)生微環(huán)境影響重大。我們的研究結(jié)果表明支持細(xì)胞中JMY缺失可損傷血睪屏障功能，同時(shí)造成生精上皮結(jié)構(gòu)紊亂、晚期生精細(xì)胞脫落，這明確提示JMY可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞連接影響血睪屏障功能并干擾精子發(fā)生過程。

與此同時(shí)，現(xiàn)有研究顯示，JMY能與肌動(dòng)蛋白互相作用，同時(shí)又能激活A(yù)rp2/3復(fù)合物，調(diào)控肌動(dòng)蛋白的組裝[10-13]。因此，支持細(xì)胞中JMY可能通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白組裝，維持支持細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)，參與維持血睪屏障功能。然而，其中的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。

從臨床角度看，我國男性不育癥的發(fā)病率呈快速上升趨勢(shì)[14]。其中，生殖系統(tǒng)的感染、炎癥、精索靜脈曲張等均會(huì)引起支持細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)紊亂和BTB功能破壞，進(jìn)而干擾精子發(fā)生、精子形成等過程，其結(jié)果造成精子畸形增多、精子數(shù)量低下、運(yùn)動(dòng)力下降，最終導(dǎo)致男性不育的發(fā)生[15-17]。因此，通過本項(xiàng)目研究探索支持細(xì)胞中JMY在維持血睪屏障中的作用，可為全面了解血睪屏障調(diào)控機(jī)制及影響精子質(zhì)量的生物學(xué)因素奠定了重要的理論基礎(chǔ)，且具有十分重要的臨床和社會(huì)意義。