hsa-miR-500a-3p對前列腺癌早期診斷及病程判斷的作用

顧佳宇 汪 洋 馮楊焜 馮寧翰

南京醫(yī)科大學附屬無錫第二醫(yī)院（江蘇無錫 214002）

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率隨著年齡的增長而升高，且呈現(xiàn)出地區(qū)差異性[1-2]。我國前列腺癌的發(fā)病率雖較歐美地區(qū)低，但隨著人口老齡化進程的加快和飲食結構的改變，其發(fā)病率逐年上升，呈現(xiàn)出惡性程度高、預后差等特點[3-4]。高通量測序被廣泛應用于小分子RNA或非編碼RNA(ncRNA)研究。隨著科學技術的進步，人們對環(huán)境中微生物的探索也從未終止過。微小RNA(miRNA)是一類高度保守內源性非編碼的小核苷酸序列，近年miRNA所介導的基因轉錄后調控的研究成果，為前列腺癌發(fā)病機制及早期診斷的研究開辟了新的思路，研究也報道稱多種miRNA可能參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[5-6]。其中miR-500a-3p的研究表明其在前列肝癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中表達上調，作為一類癌基因，影響前列腺癌細胞的侵襲和遷移能力[7-8]。本研究采用RT-PCR檢測前列腺癌、良性前列腺增生及正常患者血清中miR-500a-3p的表達水平，為前列腺癌的早期診斷提供實驗依據。

材料與方法

一、研究對象

以2017年9月至2018年7月在我院泌尿外科診治的前列腺癌、良性前列腺增生患者中采用隨機數表法各選擇30名作為研究對象，年齡（53.6±7.2）歲，所有前列腺癌及良性前列腺增生患者經穿刺活檢病理學確診且抽血前未經任何治療;排除患有高血壓、急性感染、結核病及糖尿病等疾病的患者。前列腺癌的病理分級依據2003年WHO前列腺癌病理組織學分類標準的Gleason評分，腫瘤分期按Jewett-Whitmore-Prout分期標準(即ABCD分期)。所有患者及家屬簽署知情同意書，并通過了醫(yī)院倫理委員會的審批。

二、試劑與耗材

microRNA抽提試劑盒；4S Red Plus核酸染色劑（BBI A606695）；瓊脂糖。第一鏈cDNA合成試劑盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase）(Thermo Scientific.EP0733)SW-CJ-1D潔凈工作臺 （江蘇蘇潔凈化設備廠）；HC-2518R高速冷凍離心機（安徽中科中佳儀器有限公司）；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一）；H6-1微型電泳槽 （上海精益有機玻璃制品儀器廠）；FR980凝膠成像系統(tǒng)（上海復日科技有限公司）；SMA4000微量分光光度計（merinton）；PCR反應擴增儀（BIO公司）；移液器（范圍 100-10001，20-2001，0.5-101）（加拿大BBI公司）；LightCycler480 II（Rotkreuz,Switzerland）。

三、高通量測序

由BGISEQ-500測序技術進行測序，參考Homo_sapiens （人：NCBI_GRCh38） （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）數據庫對測序結果進行整理。通過把測序得到的RNA數據與22版本的miBase數據庫（http：//www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl）里面的已知miRNA進行比對，基于比對結果對相關的miRNA進行定量分析。已知miRNA的比對分析分為兩種情況，一是miRBase數據庫里面有收錄這個物種的miRNA時，我們把測序數據與這個物種的miRNA進行比對；另一種情況是miRBase數據庫里面沒有這個物種的miRNA時，我們選擇某些物種的miRNA與基因組進行比對，把能比對上的miRNA當作這個物種的已知miRNA來分析。

四、RNA提取

這里用來提取總RNA的是柱式microRNA抽提試劑盒產品編號：B518811

組成 50次miRNAExtractor 60ml RPE Solution 12ml RNase-free water 5ml Spin Column TR with Collection Tube 50套Spin Column MR with Collection Tube 50套

保存方法及注意事項：試劑盒于常溫運輸，冷藏（2-8°C）避光保存，有效期見包裝。 miRNAExtractor是強腐蝕性物質，操作過程中應穿上實驗服，戴好乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮膚或眼睛后，請立即用清水或生理鹽水沖洗，必要時尋求醫(yī)生的幫助。

試劑準備：自備試劑：無水乙醇、氯仿等。

a.按瓶身標簽說明在RPE Solution中加入4倍體積的無水乙醇，混勻后在瓶身做好標記。于室溫密封保存。每次使用后將瓶蓋蓋緊，以保持RPE Solution中的乙醇含量。若RPE Solution由于運輸或保管不當造成容量不準，請用量筒定容后再加入相應體積的無水乙醇。

b.RNase是導致RNA降解最主要的物質，廣泛存在于人的皮膚上和體液及環(huán)境中，因此制備RNA時必須經常更換手套，同時戴上一次性口罩和衛(wèi)生帽，并保證儀器及環(huán)境清潔。

c.樣品保存：勻漿后，加氯仿前，樣品可在-70°C放置一個月以上；提取的RNA樣品可以在70%酒精中-20°C保存2個星期以上；如果需要長期保存，請于超低溫冰箱中保存。

樣品準備：取 0.3 ml凍融的血清，加入 500 μl RNase-free Water懸浮沉淀，10,000 rpm 離心 2 min，棄上清，加入1 ml miRNAExtractor，充分振蕩混勻。

提取步驟：

1.將裂解后樣品或勻漿液室溫放置5-10 min，使得核蛋白與核酸完全分離。

2.加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩30sec，室溫放置3min。12,000 rpm 4°C離心10 min。如不能旋渦混勻，可手動顛倒混勻2分鐘。樣品會分成三層：上層水相，中間層和下層有機相。RNA在上層水相中。

3.吸取上層水相轉移至干凈的離心管中，加入1.5倍體積無水乙醇 (如540 μl上清液需加入810 μl無水乙醇)，混勻。不要吸取任何中間層物質，否則會出現(xiàn)基因組DNA污染。加入無水乙醇后，可能會產生半透明纖維狀懸浮物，不影響提取和應用。

4.將吸附柱（Spin Column TR）放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加至吸附柱中，靜置1 min，12,000 rpm離心2 min，倒掉收集管中廢液。吸附柱最大有效體積為750 μl，如果混合液較多，可分兩次轉移至吸附柱。

5.將吸附柱（Spin Column TR）放回收集管中，加入500 μl RPE Solution，靜置 2 min，10,000 rpm 離心 30 s，倒掉收集管中廢液。RPE Solution使用前需檢查是否按比例加入無水乙醇。

6.重復步驟5，一次。

7.將吸附柱 （Spin Column TR）放回收集管中，12,000 rpm離心2 min。此步驟是將吸附柱中殘留的漂洗液去除，離心后將吸附柱室溫放置2 min以充分晾干，以免殘余的乙醇影響后續(xù)實驗。

8.將吸附柱放入干凈的1.5 ml離心管中，在吸附膜中央加入 30 μl RNase-free water， 靜置 2 min，12,000 rpm離心2 min，將所得到的RNA溶液置于-70°C保存或用于后續(xù)試驗。RNA在-70°C保存，以防降解。不要使用小于30μl的洗脫液進行洗脫。

五、定量PCR檢測

按照ABI公司的TaqMan.MicroRNA Reverse Transcriptionkit試劑盒操作說明書，對抽提的RNA進行體外反轉錄實驗，得到cDNA產物；反應條件為：16°C，孵育 30 min，42°C 孵育 30 min，85°C 加熱 5 min，4°C 保存。以得到的cDNA為模版，進行熒光定量PCR，采用TaqMan.Universal PCR Master Mix20μl反應體系，在羅氏LightCycler480儀器上操作，以U6作為表達檢測的內參，ΔCT表示 miR-500a-3p的相對表達，其中ΔCT=|CTU6-CTmiR-500a-3p|，反應條件為：95°C，預變性 10 min；95°C 15 s，60°C 30 s，70°C 30 s進行 40 個循環(huán)的擴增，引物信息見表1。

表1 各引物序列信息

六、統(tǒng)計分析

本研究中的數據全部采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析進行分析，其中計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用T檢驗進行統(tǒng)計分析，多組比較分析采用單因素方差分析進行，以P＜0.05作為數據有統(tǒng)計學差異的判斷標準。

結 果

一、測序結果

在前列腺癌中特異高表達的基因有：hsa-miR-500a-3p，hsa-miR-7854-3p。

圖 1 hsa-miR-500a-3p（圖 1a）和 hsa-miR-7854-3p（圖 1b）在正常前列腺、增生前列腺和前列腺癌組織中表達

相比于前列腺癌，在正常人與前列腺增生中高表達的基因有：hsa-miR-584-3p，hsa-miR-4725-3p。

圖 2 hsa-miR-584-3p（圖 2a）和 hsa-miR-4725-3p（圖 2b）在正常前列腺、增生前列腺和前列腺癌組織中表達

二、血清miR-500a-3p的表達水平分析

對各組患者血清中miR-500a-3p的表達水平進行比較。結果顯示，miR-500a-3p在前列腺癌患者血清中的表達水平較良性前列腺增生及正常人血清顯著升高，且良性前列腺增生組血清中的表達量亦較正常組高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組血清中miR-500a-3p的表達比較*P＜0.05

三、血清miR-500a-3p的表達與臨床病理參數的相關性分析

單因素方差分析和t檢驗結果顯示，前列腺癌患者血清中miR-500a-3p的表達在G1期平均為1.26±0.22，G2期平均水平為1.82±0.46，G3期平均水平為 2.53±0.71，三組兩兩相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；進一步比較發(fā)現(xiàn)G1期患者血清中miR-500a-3p的表達顯著低于 G3期患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Jewett-Whitmore-Prout臨床分期不同分期患者血清中miR-500-3p的表達水平差異顯著（P＜0.05），并且隨著分期的不斷加重，miR-500a-3p的表達水平也逐漸升高；對有發(fā)生骨轉移的患者，其miR-500a-3p的表達水平顯著高于未發(fā)生骨轉移的患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；血清tPSA水平高于10 μg/L的患者，其miR-500a-3p的表達水平顯著高于血清tPSA水平低于10 μg/L的患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而不同年齡組患者，血清中miR-500-3p的表達差異無統(tǒng)計學意義（t=0.535，P=0.596)，見表 2。

討 論

前列腺癌是發(fā)生于前列腺腺體的惡性腫瘤，在老年男性人群中發(fā)病率高，嚴重威脅患者的生命健康，給家庭和社會帶來了沉重的壓力[9]。隨著研究者對前列腺癌發(fā)病機制研究的深入，前列腺癌的診斷方法不斷改進，如酸性磷酸酶的測定、前列腺特異性抗原篩查等為前列腺的早期診斷、早期治療提供了可靠的方法[10]。MicroRNA作為宿主基因在細胞核內轉錄前體轉錄本，在細胞質內通過招募相關蛋白組成沉默復合體RISC與靶MicroRNA互補結合，降解或抑制mRNA，在轉錄后水平調節(jié)靶基因的表達[11]。雖然miR-500a-3p在腫瘤、炎癥中的作用機制尚未完全清楚，但與細胞因子存在著密切的聯(lián)系，研究發(fā)現(xiàn)其能夠通過調控NF-kB通路抑制IL-6、IL-1β及TNF-α等細胞因子的表達，能夠參與乳腺癌等多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移[12]。本研究顯示在前列腺癌患者血清中miR-500a-3p的表達水平要顯著高于良性前列腺病變及健康對照組患者，提示miR-500a-3p可能參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，為前列腺癌的早期診斷提供相關實驗依據。

表2 血清中miR-500a-3p表達與臨床指標的關系

多項研究表明miR-500a-3p在肝癌、乳腺癌等多種實體腫瘤中的表達上調。Jiang等對肝癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，miR-500a-3p在腫瘤患者癌組織中高表達，提高腫瘤細胞的肝細胞活性，與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關；進一步分析其可能通過參與調控JAK/STAT3信號通路，在肝癌中發(fā)揮生理功能[12]。Vasily等在乳腺癌中研究miR-500a-3p的表達發(fā)現(xiàn)，miR-500a-3p表達與ER陽性的乳腺癌患者的預后密切相關，高表達miR-500a-3p的患者，其預后恢復效果越差[13]。廖等對前列腺癌患者血清中的miRNA研究發(fā)現(xiàn)，miR-141在前列腺癌患者血清中表達上調，或可作為前列腺癌患者早期診斷、分期以及預后的判斷指標[14]。姚等通過定量PCR對前列腺癌患者血清以及組織，前列腺良性增生患者以及健康對照組進行研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a在前列腺患者血清與組織中均顯著低表達，可能參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，與臨床分期以及轉移密切相關[15]。

本研究結果顯示在前列腺癌患者血清中miR-500a-3p的表達水平顯著升高，并且miR-500a-3p的表達水平與前列腺癌患者疾病的不同病理分期、臨床分期、有無骨轉移有關以及血清tPSA水平密切相關（P＜0.05），表明miR-500a-3p的血清表達水平與前列腺癌的病理分期存在一定的相關性，提示血清miR-500a-3p可能是前列腺癌進展的潛在生物標志物。

綜上所述，miR-500a-3p在前列腺癌患者血清中的表達水平發(fā)生了顯著改變，提示其可能在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中有重要的作用，為前列腺癌的早期診斷及病程的判斷提供了相關實驗依據，但是其具體的分子機制以及作用靶點還需要進一步研究。